常愛敏，馬彥清，馬進，劉春霞，陳云昭，蔣金芳，李鋒

（1石河子大學醫(yī)學院病理系／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002；2伊犁州友誼醫(yī)院胸心外科，伊犁835000）

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，以鱗癌最為常見［1］，新疆北部以游牧為生的哈薩克族聚集區(qū)是我國食管癌集中高發(fā)區(qū)之一［2］。

P63基因是抑癌基因P53家族成員之一，兩者在結(jié)構和功能上均有高度同源性。P63基因某些蛋白異構體能夠反式激活P53靶基因的轉(zhuǎn)錄并誘導細胞凋亡，被認為是腫瘤抑制基因，另一些異構體則被認為是致癌基因［3］。P63蛋白是腫瘤和細胞凋亡研究領域中的熱點之一。

目前，P63在該地區(qū)食管癌癌變過程中的變化特征和作用機制尚不清楚，因此，本研究在課題組前期工作的基礎上，應用組織芯片和免疫組化技術研究P63蛋白在哈族食管鱗癌及癌旁非癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系，為進一步闡明P63基因在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料收集1996～2011年石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院、新疆伊犁州友誼醫(yī)院、新疆伊犁州新華醫(yī)院、新疆生產(chǎn)建設兵團農(nóng)四師醫(yī)院和新疆奎屯伊犁州人民醫(yī)院病理科哈薩克族食管鱗癌石蠟包埋組織標本85例。其中男性56例，女性29例，患病平均年齡59.4歲（34～78歲）。按食管癌國際TNM標準分期（2010年）。所有患者術前均未接受放化療及其他抗腫瘤治療。37例正常食管組織均來自上述腫瘤患者的癌旁非癌組織。

1.1.2主要試劑鼠抗人P63單克隆抗體（工作液1∶200）、Envision二步法試劑盒（北京中杉金橋公司）；枸櫞酸緩沖液、DAB顯色試劑盒 （Dako公司）。

1.2 方法

組織芯片的免疫組化染色采用Envision法，具體操作參照抗體說明書進行，主要步驟如下：組織標本經(jīng)過常規(guī)石蠟包埋，脫蠟水化后，于枸櫞酸緩沖液（0.01 mol／L，p H 6.0）中微波加熱進行抗原修復10 min。其余步驟嚴格按試劑盒說明書操作（抗體稀釋濃度為1∶200）。PBS代替一抗作陰性對照，由試劑公司提供的照片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

采用免疫組化Envision法檢測P63蛋白表達情況，嚴格按照免疫組化步驟進行操作，P63染色結(jié)果主要定位于細胞核，結(jié)果判定由兩位病理學專家閱片，計算陽性細胞百分比，兩位閱片專家意見不一致時請第三方閱片，最終決定免疫組化結(jié)果。

表1 免疫組化結(jié)果判定標準Tab.1 The results of immunohistochemistry criteria

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，四格表χ2檢驗及行×列表χ2檢驗，P＜0.05（雙側(cè)）有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 P63蛋白在食管鱗癌和癌旁非癌組織芯片中表達

檢測結(jié)果見圖1～4。

圖1 P63在食管鱗癌組織中細胞核表達 ＋（×100）Fig.1 Nuclear expression of P63＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

圖2 P63在食管鱗癌組織中細胞核表達 ＋＋（×100）Fig.2 Nuclear expression of P63＋ ＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

圖3 P63在食管鱗癌組織中細胞核表達 ＋＋＋（×100）Fig.3 Nuclear expression of P63＋＋＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

圖4 P63在癌旁非癌組織中細胞核表達 ＋（×100）Fig.4 Nuclear expression of P63＋in non－cancerous adjacent tissue（×100）

由85例新疆哈薩克族食管鱗癌構成的組織芯片中，P63蛋白在71例（83.5%）食管鱗癌中表達陽性，其中54例（63.5%）強陽性表達（＋＋／＋＋＋）（圖1，圖2，圖3）。37癌旁非癌組織中，22例表達陽性（圖4），表達陽性率為59.4%。經(jīng)統(tǒng)計學卡方檢驗分析，結(jié)果表明P63在食管鱗癌及癌旁非癌組織中蛋白表達差異有顯著性（χ2＝8.242，P＜0.005），且P63在哈族食管鱗癌組織中表達高于癌旁非癌組織中的表達（表2）。

表2 P63蛋白在新疆哈薩克族食管鱗癌及癌旁非癌組織中的表達情況Tab.2 The expression of p63 protein in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent non－cancerous tissue in the expression of Kazak

2.2 P63表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系

食管鱗癌中P63表達陽性率與年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可知：P63表達陽性率與年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無明顯相關性（P＞0.05）。

P63表達陽性率與新疆哈薩克族食管鱗癌分化程度有關，（χ2＝14.286，P＜0.05）。

表3 P63蛋白表達與新疆哈薩克族食管鱗癌臨床病理特征的關系Tab.3 The relationship of p63 protein and clinicopathological characteristics of esophageal squamous cell carcinoma in Xinjiang Kazakh

3 討論

P63基因是1998年Yang等［4］在人類及大鼠基因組中發(fā)現(xiàn)的一個與P53同源的基因家族新成員，定位于3q27－3q29，在結(jié)構與功能上都與P53有高度的同源性，被認為是P53家族的新成員。P53的主要功能是誘導細胞周期停滯和凋亡，具有抗腫瘤作用［5］，而P63對于上皮干細胞的增殖、生存和上皮組織的形態(tài)發(fā)生等具有重要的意義［6］。研究表明［7］，P63基因高表達于許多上皮組織的基底層與生發(fā)層，且與鱗癌的發(fā)生關系密切。

最近一項研究表明［8］，食管癌中 miR－203基因可能通過抑制靶基因△Np63介導的信號通路抑制食管癌細胞增殖。在成人表皮角質(zhì)形成細胞增殖、分化過程中，miR－203下游直接靶基因為△Np63，且在人類頭頸部及肺部鱗狀細胞癌中研究發(fā)現(xiàn)miR－203同樣可以調(diào)控△Np63 m RNA和蛋白表達水平［9－10］，這些結(jié)果提示 P63的過度表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，但具體的分子機制還不清楚，需要進一步深入的研究。

本研究首次利用組織芯片技術高通量的研究P63蛋白的表達，結(jié)果顯示，新疆哈族食管鱗癌組織中的P63蛋白呈高表達，表達陽性率為83.5%，癌旁非癌組織中的陽性表達率為59.4%，兩者陽性表達率統(tǒng)計學上有顯著差異（P＜0.01），本實驗中由于癌旁非癌組織的樣本量較小（35例）在后續(xù)試驗中講一步擴大樣本量進行研究。在食管鱗癌組織中P63表達明顯高于癌旁非癌組織中的表達，且與腫瘤的分化程度有關，提示P63參與了新疆哈薩克族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，然而，P63的高表達的是腫瘤發(fā)生的原因還是結(jié)果，尚需更進一步的研究。

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［5］Gemma K，Alderton.Morphology：Oncogenic morphs of P53［J］.Nature Reviews Cancer，2012，12（3）：155.

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