李旺林， 曹 杰， 張偉健， 楊 平， 鐘俊斌， 楊建榮， 張 通

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180)

有研究報(bào)道，巴西鉤蟲(chóng)(Nippostrongylus brasiliensis)感染導(dǎo)致腸道E－cadherin的表達(dá)改變，導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞的附著力損失［1］;而多形螺旋線蟲(chóng)(Heligmosomoides polygyrus)感染導(dǎo)致小腸上皮通透性增加［2］。但腸道蠕蟲(chóng)感染及其誘導(dǎo)的Th2反應(yīng)對(duì)結(jié)腸上皮通透性影響的相關(guān)研究較少見(jiàn)。目前還不清楚蠕蟲(chóng)感染是否可引起結(jié)腸上皮通透性改變和如何影響結(jié)腸上皮通透性。本文旨在觀察旋毛蟲(chóng)對(duì)腸道黏膜通透性影響，并初步探討其機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物及分組

選擇6到8周大的雌性BALB/c小鼠(SPF級(jí))，以高壓蒸汽消毒的食物和水喂養(yǎng)。將BALB/c鼠隨機(jī)分為2組，即T．spiralis感染組(BALB/c+T．s組)和無(wú)T．spiralis感染組(對(duì)照組，BALB/c組)。每只小鼠經(jīng)口服喂養(yǎng)T．spiralis幼蟲(chóng)400條(幼蟲(chóng)配成懸液喂養(yǎng)，并以顯微鏡鑒定為活蟲(chóng))。

2 結(jié)腸通透性的分析

小鼠感染T．spiralis7 d后，直腸內(nèi)給予辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP;Sigma)，然后測(cè)量血液中HRP濃度判定結(jié)腸通透性。在小鼠禁食12 h之后，以2%戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，50μL辣根過(guò)氧化物酶(含0．6 mg)以針頭經(jīng)直腸注入。辣根過(guò)氧化物酶灌注后的0(即為未灌注HRP的時(shí)點(diǎn))、60和120 min后，從尾靜脈收集血液樣本，采用ELISA法測(cè)定血清辣根過(guò)氧化物酶濃度。

3 血清IgG1和IgG2a的檢測(cè)

將上述尾靜脈收集的血液樣本，以ELISA法檢測(cè)IgG1和IgG2a的表達(dá)量。

4 淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)

T．spiralis感染7 d后，處死小鼠。所有小鼠經(jīng)斷頸法處死。打開(kāi)腹腔，取出腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node，MLN)。將外周淋巴結(jié)分組研磨(溶液為cDMEM)，用70μm的濾器過(guò)濾，4℃、1 500 r/min離心8 min，棄除上清，加入2 mL cDMEM溶液，將細(xì)胞振蕩溶解，將之調(diào)成5×109/L。加CD3單克隆抗體孵育，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)液上清，置于－20℃凍存。以ELISA法檢測(cè)Th2細(xì)胞因子白細(xì)胞介素4(interleukin－4，IL－4)的表達(dá)量。

5 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)

選6～8周雌性基因敲除小鼠(SPF級(jí)，BALB/c背景，購(gòu)于美國(guó)杰克森實(shí)驗(yàn)室)。將小鼠分為3組，STAT6敲除小鼠組(無(wú) T．spiralis感染，STAT6組)、BALB/c小鼠感染組(BALB/c+T．s組)和STAT6敲除小鼠感染組(STAT6+T．s組)，T．spiralis感染小鼠7 d后，先行尾靜脈取血1次(在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中標(biāo)示為0 min)，然后以HRP經(jīng)直腸注入，辣根過(guò)氧化物酶灌注后60和120 min后，從尾靜脈收集血液樣本，采用ELISA法測(cè)定血清辣根過(guò)氧化物酶濃度，以此來(lái)判定結(jié)腸上皮通透性。處死小鼠，取出腸系膜淋巴結(jié)，制作淋巴細(xì)胞懸液，加CD3單克隆抗體孵育72 h。收集上清，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子的變化。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，采用Graph-Pad Prism統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 T．spiralis感染導(dǎo)致結(jié)腸上皮通透性變化

對(duì)照組小鼠血清的辣根過(guò)氧化物酶量很少。蠕蟲(chóng)感染的小鼠血清辣根過(guò)氧化物酶水平顯著增高(HRP處理60 min后)。結(jié)果表明腸道寄生蟲(chóng)感染后結(jié)腸上皮通透性顯著增加，見(jiàn)圖1。

Figure 1．Serum HRP concentration at different time points in BALB/c mice infected with Trichinella spiralis(T．s)．BALB/c mice were infected with T．s for 7 days．On day 7，horseradish peroxidase(HRP)was infused through rectum，and then serum HRP level was detected．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．圖1 不同時(shí)點(diǎn)血清HRP濃度

2 血清IgG1和IgG2a的檢測(cè)結(jié)果

與無(wú)感染組比較，T．s感染組IgG1表達(dá)明顯增高，IgG2a表達(dá)明顯降低，見(jiàn)圖2。

Figure 2．Serum IgG1 and IgG2a．BALB/c mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，blood was collected by mice tail vein．Serum IgG1 and IgG2a were detected by ELISA．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．圖2 各組血清IgG1和IgG2a檢測(cè)結(jié)果

3 腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)結(jié)果

加CD3單克隆抗體刺激，無(wú)感染組IL－4(21．0±2．3) μg/L，感染組 IL －4(193．0 ±12．5)μg/L，感染組IL－4的表達(dá)明顯增高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3．IL－4 production of MLN in BALB/c and BALB/c+T．s mice．BALB/c mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，mice were sacrificed．MLN were collected，and then IL －4 production of MLN was detected by ELISA．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．圖3 腸系膜淋巴結(jié)IL－4的表達(dá)

4 STAT6敲除小鼠蠕蟲(chóng)感染不能改變結(jié)腸上皮通透性

BALB/c小鼠感染后血清辣根過(guò)氧化物酶水平顯著增加，有蠕蟲(chóng)感染和無(wú)感染的STAT6敲除小鼠血清辣根過(guò)氧化物酶量無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖4。

Figure 4．Serum HRPconcentration in STAT6 knockout mice experiment．BALB/c and STAT6 knockout mice were infected with T．s for 7 days．On day 7，horseradish peroxidase(HRP)was infused through rectum，and then serum HRP level was detected．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs STAT6+T．s or STAT6．圖4 STAT6敲除小鼠結(jié)腸組織HRP含量

5 STAT6敲除小鼠腸系膜淋巴結(jié)IL－4的變化

加CD3單克隆抗體刺激，BALB/c+T．s組IL－4(193．0 ±12．5)μg/L，STAT6+T．s組 IL －4(15．0±3．1)μg/L，STAT6 組 IL －4(3．0 ±1．2) μg/L，BALB/c+T．s組與 STAT6+T．s組 IL－4表達(dá)量比較，BALB/c+T．s組表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5．IL － 4 production of MLN in STAT6 knockout mice．BALB/c and STAT6 knockout mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，mice were sacrificed．MLN were collected，and then IL－4 production of MLN was detected by ELISA．ˉx±s．n=5．*P ＜0．05 vs STAT6+T．s．圖5 STAT6敲除小鼠結(jié)腸組織中IL－4含量

討 論

我們的結(jié)果表明，在野生型BALB/c小鼠中，小腸T．spiralis感染能夠?qū)е陆Y(jié)腸上皮通透性增加，但在Th2缺陷的STAT6－/－小鼠中沒(méi)有出現(xiàn)這種情況。這些結(jié)果表明，機(jī)制之一可能是旋毛蟲(chóng)感染影響了STAT6信號(hào)通路，從而改變結(jié)腸上皮屏障功能。

大分子HRP標(biāo)記探針技術(shù)已廣泛用于測(cè)量腸上皮細(xì)胞運(yùn)輸能力［3］。通常情況下，腸腔可溶性抗原通過(guò)以下2條路線進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn):經(jīng)細(xì)胞途徑或通過(guò)細(xì)胞間途徑。經(jīng)細(xì)胞的通透性對(duì)大分子通過(guò)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)重要的途徑，有助于調(diào)節(jié)免疫激活。有研究顯示，腸道蠕蟲(chóng)感染增加了腸道細(xì)菌易位和細(xì)菌脂多糖吸收加入門(mén)靜脈循環(huán)，從而改變屏障功能［4］，IL－4通過(guò)改變細(xì)胞間黏附分子明顯增強(qiáng)了高分子通透性［5］。

T．spiralis主要寄生在腸道小腸，而我們觀察的是結(jié)腸上皮屏障功能的影響。因此，結(jié)腸上皮屏障功能改變與旋毛蟲(chóng)直接導(dǎo)致的機(jī)械性損傷無(wú)關(guān)。在本研究中，我們用Th2缺陷STAT6敲除小鼠測(cè)試小腸蠕蟲(chóng)是否通過(guò)蠕蟲(chóng)引起的自適應(yīng)免疫激活間接影響結(jié)腸上皮屏障功能。我們結(jié)果表明，在BALB/c鼠中，旋毛蟲(chóng)感染導(dǎo)致了小鼠結(jié)腸上皮通透性增加，但是在Th2缺陷STAT6敲除小鼠中，T．spiralis感染卻沒(méi)有出現(xiàn)這種情況，小鼠結(jié)腸通透性并沒(méi)有因T．spiralis感染而增加。這些結(jié)果充分表明淋巴細(xì)胞活化、尤其是Th2細(xì)胞的活化，在腸道蠕蟲(chóng)感染中改變了腸道屏障作用。

Th2細(xì)胞因子IL－4和IL－13能夠通過(guò)STAT6或磷酸肌醇3－激酶(PI3K)途徑影響它們靶細(xì)胞的激活。此前，Ceponis等［6］使用T84細(xì)胞(人類(lèi)結(jié)腸上皮細(xì)胞模型)研究IL－4和IL－13參與調(diào)節(jié)上皮通透性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，認(rèn)為PI3K是IL－4和IL－13調(diào)節(jié)跨上皮電阻(TER)的主要近端信號(hào)途徑。但是，最近的研究表明，Th2(IL－13)依賴的屏障調(diào)控并不需要PI3K參與，但可能涉及STAT6，IL－13作為STAT6的抑制劑，不能抑制PI3K，但能避免IL－13誘導(dǎo)的 TER損失［7］。我們研究顯示，T．spiralis感染在STAT6敲除小鼠中未能改變結(jié)腸上皮通透性，這個(gè)結(jié)果支持了蠕蟲(chóng)感染時(shí)STAT6在調(diào)節(jié)過(guò)程中的腸上皮屏障功能的作用。這些結(jié)果進(jìn)一步提示STAT6信號(hào)通路和Th2免疫反應(yīng)在調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障中的作用。

總之，我們的研究表明，蠕蟲(chóng)感染能導(dǎo)致結(jié)腸上皮完整性和腸道上皮屏障功能的改變，而在其中一個(gè)潛在的機(jī)制可能是蠕蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的腸道黏膜上淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th2反應(yīng)參與造成的。以前研究均提示［8－10］，蠕蟲(chóng)感染中腸道黏膜免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)涉及多種作用機(jī)制，包括先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)。對(duì)蠕蟲(chóng)免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制更深一步的了解，不僅將為免疫介導(dǎo)的疾病建立新穎和更有效的治療方法，而且還能為慢性腸道蠕蟲(chóng)感染嚴(yán)重地區(qū)的微生物疾病預(yù)防和治療設(shè)計(jì)有效腸道疫苗。

［1］ Hyoh Y，Nishida M，Tegoshi T，et al．Enhancement of apoptosis with loss of cellular adherence in the villus epithelium 32 of the small intestine after infection with the neamtode Nippostrongylus brasiliensis in rats［J］．Parasitology，1999，119(2):199 －207．

［2］ Shea－ Donohue T，Sullivan C，F(xiàn)inkelman FD，et al．The role of IL－4 in Heligmosomoides polygyrus－induced alterations in murine intestinal epithelial cell function［J］．J Immunol，2001，167(4):2234 －2239．

［3］ Silva MA．Intestinal dendritic cells and epithelial barrier dysfunction in Crohn's disease［J］．Inflamm Bowel Dis，2009，15(3):436 －453．

［4］ Farid AS，Jimi F，Inagaki－Ohara K，et al．Increased intestinal endotoxin absorption during enteric nematode but not protozoal infections through a mast cell－mediated mechanism［J］．Shock，2008，29(6):709 －716

［5］ Kobayashi J，Inai T，Morita K，et al．Reciprocal regulation of permeability through a cultured keratinocyte sheet by IFN －γ and IL －4［J］．Cytokine，2004，28(4 －5):186－189．

［6］ Ceponis PJ，Botelho F，Richards CD，et al．Interleukins 4 and 13 increase intestinal epithelial permeability by a phosphatidylinositol 3－kinase pathway．Lack of evidence for STAT 6 involvement．［J］．J Biol Chem，2000，275(37):29132－29137．

［7］ Weber CR，Raleigh DR，Su L，et al．Epithelial myosin light chain kinase activation induces mucosal interleukin－ 13 expression to alter tight junction ion selectivity［J］．JBiol Chem，2010，285(16):12037 －12046．

［8］ Chen CC，Louie S，McCormick B，et al．Concurrent infection of an intestinal helminth parasite impairs host resistance to enteric Citrobacter rodentium and enhances Citrobacter－ induced colitis in mice［J］．Infect Immun，2005，73(9):5468 －5481．

［9］ Chen CC，Louie S，McCormick BA，et al．Helminthprimed dendritic cells alter the host response to enteric bacterial infection［J］．J Immunol，2006，176(1):472 －483．

［10］ Weng M，Huntley D，Huang IF，et al．Alternatively activated macrophages in intestinal helminth infection:effects on concurrent bacterial colitis［J］．J Immunol，2007，179(7):4721－4731．