牛 彥，郝夢(mèng)格，姜玲玲，石 蕓

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室神經(jīng)與血管教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)河北石家莊050017)

過氧化物酶體是存在于真核細(xì)胞中的一種具有單層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，因富含過氧化氫酶和多種過氧化物酶而得名，在脂肪酸氧化、磷脂合成和氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用[1]。過氧化物酶體的數(shù)量在不同細(xì)胞、不同生理和疾病狀態(tài)下各不相同，表明過氧化物酶體在數(shù)量上存在異質(zhì)性[2]，而探討過氧化物酶體的這種異質(zhì)性在研究微環(huán)境對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響方面具有重要作用。過氧化物酶體的數(shù)量由其生物發(fā)生[3]和降解兩方面決定。哺乳動(dòng)物過氧化物酶體的降解途徑有3種:過氧化物酶體自噬、依賴LON多肽酶的過氧化物酶體降解和依賴12/15-脂氧合酶(12/15-lipoxygenase，12/15-LOX)的過氧化物酶體降解。本文就這些降解途徑及其與疾病的關(guān)系進(jìn)行綜述，以期對(duì)過氧化物酶體的降解過程及其在疾病中的作用有更深的認(rèn)識(shí)。

1 過氧化物酶體自噬

過氧化物酶體自噬是過氧化物酶體降解的主要形式[4]。雖然不同刺激因素引起的過氧化物酶體自噬的具體過程不盡相同，但目前較為確定的一個(gè)模式是，當(dāng)各種因素導(dǎo)致過氧化物酶體自噬發(fā)生時(shí)，首先，過氧化物酶體膜上的某些蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化，隨后泛素化的膜蛋白由NBR1(neighbor of BRCA1 gene 1)或p62或其他蛋白質(zhì)介導(dǎo)與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3)結(jié)合，形成自噬小體，這些自噬小體進(jìn)一步與溶酶體融合而被降解[5]。

過氧化物酶體膜上存在多種蛋白質(zhì)，它們被稱為過氧化物酶體膜蛋白(peroxisomal membrane protein，PMP)，其中，在過氧化物酶體生物發(fā)生中發(fā)揮重要作用的一類蛋白質(zhì)被稱為PEX(peroxin)。目前研究最透徹的是PEX5與過氧化物酶體自噬的關(guān)系。在過氧化物酶體生物發(fā)生過程中，PEX5負(fù)責(zé)過氧化物酶體基質(zhì)蛋白向基質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，但在氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，PEX5會(huì)將一個(gè)重要的蛋白激酶——毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白激酶(ataxia telangiectasia-mutated kinase，ATM)定位到過氧化物酶體膜上，從而開啟過氧化物酶體自噬。研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠肝癌FAO細(xì)胞或人肝癌HepG2細(xì)胞過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)刺激后，細(xì)胞中的ATM激酶通過其氨基酸序列中的PEX5結(jié)合區(qū)與PEX5結(jié)合，進(jìn)而定位到過氧化物酶體膜上而活化，活化的ATM隨后磷酸化PEX5的S141位點(diǎn)，磷酸化的PEX5會(huì)使同樣位于過氧化物酶體膜上的PEX2/10/12復(fù)合體發(fā)生構(gòu)象改變，從而發(fā)揮出E3連接酶活性，泛素化PEX5的K209位點(diǎn)，泛素化的PEX5進(jìn)而與p62結(jié)合，最終引發(fā)自噬[6]。將此過程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)阻斷，比如通過點(diǎn)突變分別抑制ATM到過氧化物酶體的定位、PEX5的磷酸化、PEX5的泛素化，再給予H2O2刺激，過氧化物酶體自噬均被抑制。除了外源給予H2O2外，利用干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)敲低或特異性抑制劑3-氨基三唑抑制過氧化氫酶的表達(dá)或活性也能增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，促進(jìn)過氧化物酶體自噬[7]。這些結(jié)果表明，氧化應(yīng)激引起的過氧化物酶體自噬是ATM-PEX5依賴性的。有意思的是，PEX5的泛素化位點(diǎn)并不局限于K209，另一個(gè)位點(diǎn)C11的泛素化也由PEX2/10/12復(fù)合體催化，但C11泛素化的PEX5，會(huì)在同樣位于過氧化物酶體膜上的AAA ATP酶復(fù)合體(ATPases associated with diverse cellular activities)的核心組分PEX1和PEX6形成的六聚體作用下，從過氧化物酶體膜上脫離，從而阻止過氧化物酶體的自噬[8]。所以，雖然由相同的泛素化酶催化，但催化的位點(diǎn)不一樣，過氧化物酶體的結(jié)局也就不同。

除了氧化應(yīng)激，氨基酸饑餓是另一個(gè)引起過氧化物酶體自噬的常見因素。用不含氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞24 h后，檢測(cè)細(xì)胞的過氧化物酶體自噬情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中過氧化物酶體自噬被促進(jìn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種由饑餓引起的自噬也需要PEX5的泛素化[9]。那么，此時(shí)PEX5的泛素化是否與氧化應(yīng)激條件下一致，都是由PEX2/10/12復(fù)合體催化的呢？將HEK293-HAUb(HA-tagged ubiquitin)細(xì)胞中的 PEX2、PEX10和PEX12分別敲低，再給予不含氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞中PEX5的泛素化情況，發(fā)現(xiàn)只有PEX2敲低的細(xì)胞中沒有檢測(cè)到PEX5的泛素化，而敲低PEX10或PEX12并不影響PEX5的泛素化，表明正是 PEX2，而非PEX10或 PEX12，使PEX5發(fā)生了泛素化，這一點(diǎn)與氧化應(yīng)激刺激下需要PEX2/10/12復(fù)合體來泛素化PEX5并不相同。除了PEX5，相同條件下，研究人員也檢測(cè)到PMP70的泛素化改變，而且變化情況與PEX5一致。PMP70是過氧化物酶體膜上含量最高的膜蛋白，這一結(jié)果表明除了PEX5，PMP70也是PEX2這一E3連接酶的底物，而且泛素化的PMP70也參與氨基酸饑餓誘導(dǎo)的過氧化物酶體自噬[9]。除了泛素化，這些過氧化物酶體的膜蛋白還受到去泛素化調(diào)節(jié)。去泛素化也需要酶的催化，而泛素特異性肽酶30(ubiquitin specific peptidase 30，USP30)就是一個(gè)新近確認(rèn)的能抑制過氧化物酶體自噬的去泛素化酶[10]。在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)USP30，檢測(cè)其亞細(xì)胞定位后發(fā)現(xiàn)，USP30與過氧化物酶體存在共定位，但是關(guān)于USP30是如何定位到過氧化物酶體的，目前還沒有直接證據(jù)，推測(cè)可能與PEX16 或 PEX19 有關(guān)[11～12]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)USP30后，原本由于氨基酸饑餓誘導(dǎo)的過氧化物酶體自噬被逆轉(zhuǎn)，而突變的USP30卻沒有這種逆轉(zhuǎn)能力，說明USP30確實(shí)能夠抑制過氧化物酶體的自噬。既然USP30是去泛素化酶，那么，它的底物是否也是這些過氧化物酶體的膜蛋白呢？將HEK293-HA-Ub細(xì)胞中的USP30敲低，再給予不含氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞中PEX5、PMP70以及過氧化物酶體基質(zhì)蛋白過氧化氫酶的泛素化情況，發(fā)現(xiàn)PEX5和PMP70的泛素化程度增加，而過氧化氫酶的泛素化程度沒有明顯改變[11]。PEX5和PMP70是泛素化酶PEX2的底物，這一結(jié)果表明USP30能夠通過拮抗PEX2來調(diào)節(jié)過氧化物酶體的自噬情況，從而平衡細(xì)胞中過氧化物酶體的數(shù)量。

低氧也能誘導(dǎo)自噬。低氧條件下，脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)的活性受到抑制，使低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)不能被羥化，進(jìn)而不能被泛素化酶VHL(von Hippel-Lindau)泛素化，導(dǎo)致HIF不能進(jìn)入蛋白酶體降解而穩(wěn)定存在于細(xì)胞中，因此，HIF常被認(rèn)為是低氧的標(biāo)志物[13]。利用VHL-/-基因敲除小鼠[14]或PHD抑制劑二甲基乙二?；拾彼?(dimethyloxaloylglycine，DMOG)[15]穩(wěn)定組織或細(xì)胞中HIF的水平來模擬低氧環(huán)境，再檢測(cè)過氧化物酶體的自噬情況，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體的自噬均被促進(jìn)，并且這種自噬是HIF-2α依賴性的。低氧在惡性腫瘤中廣泛存在，既然低氧能促進(jìn)過氧化物酶體自噬，那么，過氧化物酶體自噬是否與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)呢？研究發(fā)現(xiàn)，PEX2在肝癌組織中表達(dá)增加，而敲低PEX2的表達(dá)會(huì)顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖；不出所料，敲低PEX10或PEX12也得到了相同的結(jié)果[16]。同樣，敲低ATM的表達(dá)也能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，不僅如此，還能抑制其遷移和侵襲[17]。這些過氧化物酶體自噬相關(guān)分子在腫瘤中的表達(dá)變化，很可能意味著過氧化物酶體自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

過氧化物酶體生物發(fā)生缺陷病(peroxisome biogenesis disorder，PBD)是最為典型的與過氧化物酶體自噬異常有關(guān)的疾病。一直以來，人們都認(rèn)為是參與過氧化物酶體生物發(fā)生的PEX基因突變，使過氧化物酶體的生物發(fā)生過程不能正常進(jìn)行，導(dǎo)致成熟的過氧化物酶體缺失，從而引發(fā)PBD，但最近這種觀點(diǎn)卻有所改變，因?yàn)樽畛Ｒ姷腜BD的基因突變是發(fā)生在構(gòu)成AAA ATP酶復(fù)合體的3個(gè)基因，即PEX1、PEX6和PEX26，突變占比分別為48.5%、13.1%和3.4%。如前所述，AAA ATP酶復(fù)合體能夠使泛素化的PEX5從過氧化物酶體膜上脫離，從而阻止過氧化物酶體自噬的進(jìn)程，進(jìn)而使其保留下來，但突變的復(fù)合體就喪失了這種能力，過氧化物酶體會(huì)繼續(xù)自噬的進(jìn)程從而導(dǎo)致過氧化物酶體數(shù)量的減少[18]，所以，目前認(rèn)為，至少65%的PBD都與過氧化物酶體的過度自噬有關(guān)[19]。如果真是這樣，反而為PBD提供了一個(gè)新的治療方向，即通過藥物抑制過氧化物酶體自噬，以達(dá)到增加過氧化物酶體數(shù)量的目的。已有研究發(fā)現(xiàn)，以PEX1缺失(PEX1 null)或突變(PEX1-G843D)病人的成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象，分別給予3種不同的自噬抑制劑(LY294002、bafilomycin A1或chloroquine)刺激24 h，細(xì)胞中過氧化物酶體的數(shù)量均顯著增加，其中，PEX1-G843D細(xì)胞中過氧化物酶體的數(shù)量甚至達(dá)到與野生型細(xì)胞中相似的程度[18]。因此，抑制過氧化物酶體的自噬有望成為新的PBD治療靶點(diǎn)。

2 依賴LON多肽酶的過氧化物酶體降解

LONP2(Lon peptidase 2，peroxisomal)是過氧化物酶體特異的LON多肽酶，其主要功能是催化過氧化物酶體內(nèi)部基質(zhì)蛋白的降解[20]。正常情況下，LONP2會(huì)發(fā)揮類似分子伴侶的功能，協(xié)助蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊；而當(dāng)氧化應(yīng)激、衰老等因素導(dǎo)致過氧化物酶體基質(zhì)蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊或損傷時(shí)，LONP2會(huì)及時(shí)降解這些蛋白質(zhì)，以保證過氧化物酶體的正常運(yùn)行。但是，當(dāng)錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白質(zhì)過多，超過LONP2的降解能力時(shí)，過氧化物酶體就會(huì)發(fā)生自溶，由于這種過氧化物酶體降解的方式需要LONP2的參與，因此，稱其為依賴LON多肽酶的過氧化物酶體降解。

目前，對(duì)于這個(gè)過程的很多細(xì)節(jié)尚不清楚，而有關(guān)其與疾病之間關(guān)系的研究更是少之又少。有學(xué)者將LONP2與存在于線粒體中的另一種LON多肽酶——LONP1進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者在結(jié)構(gòu)上有近40%的相似性，結(jié)構(gòu)上的相似決定了功能上的相似，而目前發(fā)現(xiàn)，二者在蛋白質(zhì)的水解以及對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)性上差別不大，又由于LONP1已被證實(shí)在衰老以及衰老相關(guān)疾病中對(duì)維持線粒體完整性起重要作用，因此，推測(cè)在結(jié)構(gòu)和功能上與LONP1都相似的LONP2，也應(yīng)該在這些疾病中發(fā)揮作用，但目前為止，尚沒有這方面的報(bào)道[20]。不過值得注意的是，LONP2與癌癥之間關(guān)系的研究已有所突破。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，宮頸癌組織中LONP2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯增加；而敲低人宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞中LONP2的表達(dá)水平能夠抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)降低ROS水平[21]。這些結(jié)果提示，LONP2促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，可能是宮頸癌潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，但是LONP2如何促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生？是否與過氧化物酶體降解有關(guān)？還需要進(jìn)一步的研究。

3 依賴12/15-LOX的過氧化物酶體降解

12/15-LOX是一種特殊的酶，它可以在無需磷脂酶的情況下，直接氧化含有多不飽和脂肪酸的脂膜，從而達(dá)到破壞細(xì)胞器，甚至細(xì)胞的目的。12/15-LOX和過氧化氫酶的雙免疫熒光染色以及免疫電鏡膠體金標(biāo)記法都確認(rèn)12/15-LOX定位到過氧化物酶體，而有活性的12/15-LOX能夠破壞過氧化物酶體的膜結(jié)構(gòu)，致使位于內(nèi)部的基質(zhì)蛋白(過氧化氫酶)外泄，說明12/15-LOX能夠通過破壞過氧化物酶體的單層膜結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致過氧化物酶體降解[22]。12/15-LOX在糖尿病腦病[23]、中風(fēng)[24]和阿爾茨海默病[25]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表達(dá)上調(diào)，利用12/15-LOX基因敲除小鼠或特異性抑制劑抑制12/15-LOX的活性，能相應(yīng)減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷[24～26]。在體內(nèi)構(gòu)建的Lewis肺癌小鼠模型中，12/15-LOX在內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性過表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡[27]。這些結(jié)果都提示，12/15-LOX的表達(dá)或活性異常與神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，通過開發(fā)相應(yīng)的藥物來糾正這種異常很可能為這些疾病的治療提供新的方向，但12/15-LOX引發(fā)這些疾病的具體機(jī)制以及過氧化物酶體降解在其中的作用，目前為止，尚不得而知。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，過氧化物酶體的降解與其生物發(fā)生過程一起，共同維持著細(xì)胞中過氧化物酶體數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡。平衡一旦被打破，將會(huì)引發(fā)過氧化物酶體的功能紊亂，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。目前，過氧化物酶體降解發(fā)生的具體過程尚有許多方面有待完善，比如:1)除了PEX5和PMP70，還有沒有其他關(guān)鍵分子也是過氧化物酶體自噬的開關(guān)分子，這些分子一旦發(fā)生泛素化，就使得過氧化物酶體朝著自噬的方向發(fā)展；2)除了泛素化這種修飾，還有沒有其他修飾方式也能誘導(dǎo)過氧化物酶體自噬；3)氧化應(yīng)激、氨基酸饑餓、低氧等不同刺激方式均能誘導(dǎo)過氧化物酶體自噬，但這些“殊途”的刺激方式是如何共同誘導(dǎo)過氧化物酶體自噬而達(dá)到“同歸”效果的，導(dǎo)致這種現(xiàn)象發(fā)生的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)到底是什么；4)為什么過氧化物酶體自噬在過氧化物酶體的降解中占主要地位，而依賴LON多肽酶和依賴12/15-LOX的過氧化物酶體降解的發(fā)生卻相對(duì)較少。這些問題只是冰山一角，而隨著這些問題的出現(xiàn)和不斷被解答，我們對(duì)于過氧化物酶體的降解過程及其與疾病關(guān)系的認(rèn)識(shí)將會(huì)愈加深入，最終有利于為這些疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。