馬穎，劉忞之，王偉

轉(zhuǎn)肽酶A在蛋白質(zhì)和多肽修飾中的應(yīng)用

馬穎，劉忞之，王偉

在20世紀(jì)90年代末，Navarre 和 Schneewind[1]首次在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)肽酶 A（sortase A），它催化了表面蛋白與多種革蘭陽性菌的肽聚糖骨架的共價結(jié)合，從而開啟了轉(zhuǎn)肽酶A對蛋白質(zhì)或多肽作用的研究[2-10]。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)從金黃色葡萄球菌中分離得到的轉(zhuǎn)肽酶A在蛋白質(zhì)或多肽的合成與修飾中表現(xiàn)出了良好的反應(yīng)活性和特異性[11]。轉(zhuǎn)肽酶A可以特異性結(jié)合蛋白質(zhì) C末端的 LPXTG 序列（X 是任意氨基酸），切斷蘇氨酸和甘氨酸之間的肽鍵，而后與 N-端含有甘氨酸殘基的蛋白質(zhì)或多肽末端連接形成肽鍵[11-12]。轉(zhuǎn)肽酶A不僅可以用于修飾蛋白質(zhì)或多肽增強(qiáng)其穩(wěn)定性和活性，還可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和多肽以及多肽和多肽之間的特異性位點的連接[13]；其催化反應(yīng)的高特異性使得轉(zhuǎn)肽酶A在蛋白質(zhì)或多肽合成與修飾中得到了廣泛的應(yīng)用。本文就轉(zhuǎn)肽酶A的作用機(jī)制、結(jié)構(gòu)特征及其在蛋白質(zhì)和多肽修飾中的應(yīng)用展開綜述。

1 轉(zhuǎn)肽酶A的作用機(jī)制及結(jié)構(gòu)特征

轉(zhuǎn)肽酶A是一種膜結(jié)合巰基轉(zhuǎn)肽酶[12]，能夠特異性地識別蛋白質(zhì)或多肽 C端的保守氨基酸序列 LPXTG（X 指任意氨基酸）。首先，轉(zhuǎn)肽酶A的 184 位半胱氨酸上的巰基進(jìn)攻蘇氨酸（Thr）和甘氨酸（Gly）之間的肽鍵，生成乙?；霓D(zhuǎn)肽酶A中間產(chǎn)物，然后另一蛋白質(zhì)或多肽N端的甘氨酸的氨基親核進(jìn)攻硫酯中間體，使得親核基團(tuán)和蘇氨酸之間的肽鍵形成，而原有的保守序列 LPXTG 中的甘氨酸殘基及其相關(guān)部分被切除（圖 1）[14-17]。

圖1 轉(zhuǎn)肽酶A作用機(jī)制[17]

對于轉(zhuǎn)肽酶A的三維結(jié)構(gòu)，Bradshaw 等[12]利用 NMR進(jìn)行了解析（圖 2A）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)肽酶A包含 2 個短螺旋和 8 個 β 折疊結(jié)構(gòu)。后經(jīng)其他研究表明，在其第 4 個和第 7 個 β 折疊的筒狀結(jié)構(gòu)的一側(cè)具有一個疏水溝，這個結(jié)構(gòu)被 β2-β3、β3-β4、β6-β7 和 β7-β8 四個 loop 結(jié)構(gòu)包圍，催化中心 His120、Cys184、Arg197分別位于 β4 和 β7 的尾部以及 β8 起始端的溝中（圖 2B）[18-20]，該結(jié)構(gòu)可以容納并識別底物，發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。

轉(zhuǎn)肽酶A通過催化活性中心的 Val166、Val168和Leu169識別 LPXTG 序列[19]。這三個氨基酸殘基位于β6-β7 的 loop 區(qū)，這一 loop 結(jié)構(gòu)在結(jié)合底物的過程中由一個無序的開放狀態(tài)變?yōu)橛行虻拈]合狀態(tài)。而閉合結(jié)構(gòu)β6-β7 loop 區(qū)的穩(wěn)定性是由鈣離子與 β6-β7 loop 區(qū)的Glu171、β3-β4 loop 區(qū)的 Glu105、Glu108和 Asp112結(jié)合所決定的（圖 2C）。因此，鈣離子的結(jié)合可增強(qiáng)酶對底物的親和力，鈣離子濃度低時催化效率也低，對鈣離子的高度依賴性限制了轉(zhuǎn)肽酶A的使用范圍。

2 轉(zhuǎn)肽酶A的蛋白質(zhì)工程及催化活性的研究

為了解決鈣離子濃度依賴而催化效率低的問題，Hirakawa 研究組于 2012 年開展了不同菌株的轉(zhuǎn)肽酶 A催化特性的對比實驗研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthraci）的轉(zhuǎn)肽酶A本身就是非依賴鈣離子的，說明對鈣離子的依賴是金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A的特性。因此，Hirakawa 等提出可以通過突變獲得鈣離子非依賴的轉(zhuǎn)肽酶A。他們對來源于化膿性鏈球菌和炭疽芽胞桿菌的轉(zhuǎn)肽酶及其他轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)肽酶家族的酶活性位點區(qū)域高度保守，但是側(cè)鏈的鈣離子結(jié)合位點區(qū)域并不保守，即對應(yīng)于轉(zhuǎn)肽酶A的第 105 位和第 108 位氨基酸殘基在其他兩個轉(zhuǎn)肽酶中不保守。于是他們設(shè)計了五組突變體，即E105K、E108A、E108Q、E105K/E108A 和 E105K/E108Q。通過對結(jié)果進(jìn)行分析，得到了在鈣離子不存在的情況下，仍可發(fā)生催化反應(yīng)的雙突變體（E105K/E108A 和E105K/E108Q），只是催化效率較野生型有所降低[21]。

該研究組為解決雙突變體催化效率低的問題，繼續(xù)開展了轉(zhuǎn)肽酶A的突變研究。他們合成（或表達(dá)）了引入五個突變位點（P94R/D160N/D165A/K190E/K196T）的轉(zhuǎn)肽酶A，這一突變體在沒有鈣離子的情況下不具有催化活性，但是將五個突變位點引入雙突變體，形成的具有七個突變位點的轉(zhuǎn)肽酶 A，不僅可不依賴于鈣離子進(jìn)行轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，而且活性較野生型的酶提高了 120 倍[22]。由此可見，具有七個突變位點的轉(zhuǎn)肽酶A將成為選擇性蛋白連接的強(qiáng)有力工具。

圖2 轉(zhuǎn)肽酶A結(jié)構(gòu)特征（A：轉(zhuǎn)肽酶A的三維結(jié)構(gòu)；B：催化中心結(jié)構(gòu)；C：鈣離子結(jié)合區(qū)）[12,21]

3 轉(zhuǎn)肽酶A在蛋白質(zhì)或多肽修飾中的研究進(jìn)展

轉(zhuǎn)肽酶A對于底物的特異性，使之成為對蛋白或多肽特異性修飾的一個重要工具。關(guān)于轉(zhuǎn)肽酶A的多種應(yīng)用已經(jīng)被報道，例如蛋白連接[23]、細(xì)胞表面蛋白標(biāo)記[24-25]、蛋白-脂質(zhì)連接[26]和蛋白質(zhì)與多肽的環(huán)化[27-28]等。

2004 年，Mao 等[29]通過將天然多肽以及非天然多肽連接到 LPXTG 標(biāo)記的綠色熒光蛋白上，首次證實了轉(zhuǎn)肽酶A 催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)可以作為蛋白質(zhì)修飾的一個重要工具。2009 年，Antos 等[30]擴(kuò)大了其在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用。此后，轉(zhuǎn)肽酶A被用于修飾多種結(jié)構(gòu)不同的多肽序列[23,31-33]。2011 年，Popp 等[34]又發(fā)現(xiàn)應(yīng)用轉(zhuǎn)肽酶A的環(huán)化作用可增加細(xì)胞因子的穩(wěn)定性。在已報道的關(guān)于轉(zhuǎn)肽酶A 應(yīng)用的諸多研究中，多數(shù)是闡述轉(zhuǎn)肽酶A用于蛋白質(zhì)修飾，尤其是其在環(huán)肽的生物合成中的應(yīng)用[27,35-40]。

3.1 增加細(xì)胞因子的穩(wěn)定性

重組蛋白療法因血循環(huán)半衰期短或穩(wěn)定性較差使得臨床療效差。盡管聚乙二醇綴合修飾可延長很多蛋白質(zhì)的半衰期，但是這種方法存在特異性差的弊端，使得蛋白質(zhì)的生物活性喪失。Popp 等[34]以具有四個螺旋結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子為例，利用轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)來促進(jìn)聚乙二醇和細(xì)胞因子的位點特異性結(jié)合，實現(xiàn)了在不影響活性的前提下延長細(xì)胞因子半衰期的目的。

3.2 標(biāo)記蛋白或多肽

目前轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)已成功地應(yīng)用于目的蛋白的多肽標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性金屬復(fù)合物標(biāo)記、聚乙二醇衍生物標(biāo)記、多聚蛋白標(biāo)簽標(biāo)記等[40]。研究表明，在利用轉(zhuǎn)肽酶A對蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行標(biāo)記時，需先將目的蛋白構(gòu)建成具有轉(zhuǎn)肽酶識別位點（LPXTG）的形式[41]，然后通過轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)實現(xiàn)目的蛋白的多肽標(biāo)記。

3.3 蛋白-蛋白融合

2004 年，Pollok 研究組首次闡述了轉(zhuǎn)肽酶A可用作催化多肽和多肽、多肽和蛋白、蛋白和蛋白融合的工具酶[29]。在研究中，他們以一系列含有不同甘氨酸殘基數(shù)（1/2/3/5）的短肽和含有轉(zhuǎn)肽酶A識別序列的熒光蛋白為底物，通過檢測熒光蛋白熒光信號的變化來證實融合反應(yīng)的完成。從此，轉(zhuǎn)肽酶A被用于各種不同長度的蛋白或多肽鏈之間的融合[1,33,42-43]。

3.4 蛋白質(zhì)或多肽的環(huán)化

蛋白質(zhì)或多肽的穩(wěn)定性差限制了其在臨床治療與實驗研究中的應(yīng)用，而環(huán)狀結(jié)構(gòu)因具有環(huán)化骨架及二硫鍵結(jié)構(gòu)可大大增強(qiáng)蛋白質(zhì)或多肽的穩(wěn)定性。環(huán)肽由于含有共價閉合的酰胺骨架而具有獨特的特性，使得它作為多肽中一種特殊肽類而存在。自然存在的環(huán)肽通常含有 14～78 個氨基酸殘基，與線形肽相比，環(huán)肽具有更強(qiáng)的蛋白酶穩(wěn)定性[37]、化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[30]。除自然存在的環(huán)肽外，環(huán)狀肽也可通過化學(xué)方法、其他連接方法或酶介導(dǎo)法獲得。在這些方法中，化學(xué)方法及其他連接方法存在產(chǎn)量低、純化困難等問題，而酶法介導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng)不僅產(chǎn)量高，而且特異性強(qiáng)，利于純化。

Ploegh 實驗組首次報道了轉(zhuǎn)肽酶A可介導(dǎo) C-端含有LPXTG 識別序列且 N-端含有甘氨酸殘基的蛋白環(huán)化[30]，這使得轉(zhuǎn)肽酶A的應(yīng)用不再局限于分子間的反應(yīng)，分子內(nèi)的快速且簡單的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)同樣受到關(guān)注（圖 3）。從此，轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng)得以更廣泛深入的研究。

2009 年，Antos 等[30]利用轉(zhuǎn)肽酶A環(huán)化了三種不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)底物（Cre 融合酶、eGFP 和 UCHL3），通過對這三種不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)底物及其環(huán)化后產(chǎn)物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)肽酶A催化的環(huán)化反應(yīng)是可逆的，并且具有反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)等特點。Antos 等首先將 Cre 和 eGFP 構(gòu)建成 C 端含有轉(zhuǎn)肽酶識別序列、N 端含有甘氨酸殘基的蛋白底物，通過與轉(zhuǎn)肽酶A反應(yīng)，得到環(huán)化產(chǎn)物，經(jīng)驗證確定了 Cre 和 eGFP 發(fā)生了分子內(nèi)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在已環(huán)化的產(chǎn)物中仍然含有轉(zhuǎn)肽酶A識別序列，后經(jīng)進(jìn)一步實驗證明，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)肽酶A也可以剪切環(huán)肽中的蘇氨酸和甘氨酸之間的肽鍵，使環(huán)肽再次轉(zhuǎn)變?yōu)榫€形肽，也就是說轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的反應(yīng)是可逆的，在環(huán)肽與線性肽之間存在一個平衡。此外，通過對 eGFP 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過修飾的 N-端和 C-端位于 β 折疊的同一端，是環(huán)化反應(yīng)的理想的底物結(jié)構(gòu)。但是，將轉(zhuǎn)肽酶A識別序列構(gòu)建在泛素化 C-端水解酶（UCHL3）內(nèi)部的一個交叉環(huán)上，環(huán)化反應(yīng)仍可發(fā)生，且發(fā)生反應(yīng)的方式與 eGFP 相同。由此可見轉(zhuǎn)肽酶A催化的環(huán)化反應(yīng)具有反應(yīng)特異性強(qiáng)的特點。

轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的環(huán)化作用受底物多肽長度的影響，后者至少長達(dá) 19 個肽，才可得到單體直接環(huán)化的環(huán)肽。Wu等[39]分別將含有 17、18、19 個氨基酸殘基的肽鏈與轉(zhuǎn)肽酶A進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)得到的單體環(huán)肽隨線性肽氨基酸殘基數(shù)量的增加而增加，而二聚體及三聚體環(huán)肽隨線性肽氨基酸數(shù)量的增加而減少。另外，該酶也可以催化富含二硫鍵的多肽環(huán)化，Jia 等[27]通過研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)肽酶A對于富含二硫鍵的多肽具有廣泛適用性。在研究中，他們利用轉(zhuǎn)肽酶A分別將 kalata B1、α-芋螺霉素 Vc1.1 和向日葵胰蛋白酶抑制劑 1 進(jìn)行環(huán)化，這些多肽含有 14～29 個氨基酸殘基，在環(huán)化生成的環(huán)肽中分別具有 3、2 和 1 個二硫鍵。

轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng)在提高環(huán)肽產(chǎn)量以及多肽活性方面發(fā)揮著重要作用。2011 年，Bolscher 等[38]以histatin-1 作為模板，分別通過化學(xué)法和轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)對模板蛋白進(jìn)行環(huán)化。實驗結(jié)果表明，化學(xué)法僅得到約 3% 的環(huán)肽，而轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)量則大于90%；另外，在傷口愈合活性方面，10 nmol/L 的環(huán)肽即可達(dá)到最大傷口愈合活性，而線形肽達(dá)到此活性需要 10 μmol/L。由此可見，轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的環(huán)化對于環(huán)肽產(chǎn)量以及多肽活性的提高具有重要作用。

此外，在本研究組的前期研究中，構(gòu)建了含有雙親和色譜標(biāo)簽的融合轉(zhuǎn)肽酶 A，并通過酶促動力學(xué)實驗證明了融合標(biāo)簽對于轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的催化活性沒有影響[44]，初步建立可固定化轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的多肽環(huán)化方法。

綜上所述，轉(zhuǎn)肽酶A催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)為多肽和蛋白的環(huán)化提供了一種較好的方法。與化學(xué)法合成環(huán)肽的方法相對比，轉(zhuǎn)肽酶A催化的反應(yīng)具有產(chǎn)量高和特異性強(qiáng)的特點。因此，通過對目的蛋白進(jìn)行適當(dāng)修飾，利用轉(zhuǎn)肽酶催化的反應(yīng)獲得環(huán)肽無疑更具有潛力。

圖3 轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的分子內(nèi)與分子間轉(zhuǎn)肽反應(yīng)[30]

4 小結(jié)

盡管金黃色葡萄球菌的轉(zhuǎn)肽酶A及其突變體有著快速高效地催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的優(yōu)點，但是反應(yīng)的可逆性依然是一個不可忽視的缺陷。目標(biāo)蛋白或多肽與轉(zhuǎn)肽反應(yīng)產(chǎn)物之間存在平衡，為提高轉(zhuǎn)肽反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)率通常使用過量的含有多聚甘氨酸的多肽底物（衍生物或親核分子）促進(jìn)正向的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)；這從一定程度上導(dǎo)致了多聚甘氨酸親核試劑的浪費(fèi)和目標(biāo)產(chǎn)物的純化困難。為解決逆反應(yīng)的不足，已有研究報道利用轉(zhuǎn)肽酶A對識別位點 C-端結(jié)構(gòu)的非特異性合成含有縮肽（depsipeptide）類或經(jīng)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)后形成二酮哌嗪的類多肽標(biāo)記底物用于目標(biāo)蛋白的 N-端標(biāo)記[45-46]。這些實驗結(jié)果為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)肽酶A的正向轉(zhuǎn)肽反應(yīng)效率的深入研究奠定了基礎(chǔ)。不僅如此，目前還通過定向進(jìn)化和噬菌體展示技術(shù)獲得了識別不同位點（APxTG 或 FPxTG）的突變體和從其他菌株如溶血性葡萄球菌（Staphylococcus simulans）中鑒定出識別位點為 LXPTG 的轉(zhuǎn)肽酶，這將促進(jìn)轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的蛋白或多肽不同標(biāo)記修飾的應(yīng)用[47-48]。

自首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)肽酶A至今已將近 20 年，對于它的應(yīng)用研究也已有 10 多年，轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的酶法連接逐漸被認(rèn)為可以用于替代天然化學(xué)連接法。轉(zhuǎn)肽酶A對于識別序列 LPXTG 具有很高的特異性，使其在蛋白質(zhì)或多肽的修飾方面具有很高的應(yīng)用價值，其中最重要的應(yīng)用是利用轉(zhuǎn)肽酶A標(biāo)記的抗體類藥物在臨床診斷和治療中發(fā)揮了重要作用[40,49]。在環(huán)肽研究方面，由于環(huán)化的多肽比線性多肽具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，使得蛋白質(zhì)或多肽在疾病治療方面具有更廣泛的潛在價值[37]。此外，隨著蛋白或多肽傳遞（BioPorter）技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)肽酶A已發(fā)展成為活細(xì)胞內(nèi)直接進(jìn)行蛋白標(biāo)記的分子工具[50-51]。因此，可以預(yù)見隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多的研究將被用于轉(zhuǎn)肽酶A的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，發(fā)掘其更多的潛在功能，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，作為強(qiáng)大的蛋白質(zhì)或多肽修飾工具，轉(zhuǎn)肽酶A將被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥研究。

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中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-3-012）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院“協(xié)和青年基金”（3332016057）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗實驗室/國家衛(wèi)生和計劃生育委員會天然藥物生物合成重點實驗室

王偉，Email：wwang@imm.ac.cn

2017-02-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.010