韓婷，魏維，戈梅，錢秀萍

調(diào)控基因?qū)θf古霉素生物合成的影響

韓婷，魏維，戈梅，錢秀萍

目的通過對(duì)東方擬無枝酸菌的調(diào)控基因進(jìn)行研究及改造以獲得高產(chǎn)萬古霉素的突變株。

萬古霉素； 調(diào)節(jié)元件，轉(zhuǎn)錄； 東方擬無枝酸菌

20 世紀(jì) 80 年代，由于 β-內(nèi)酰胺類抗生素的大量使用，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）逐漸流行，目前，萬古霉素是臨床上用于由 MRSA 引起的嚴(yán)重感染性疾病的一線藥物，受到人們的重視[1]。東方擬無枝酸菌（Amycolatopsisorientalis）是萬古霉素的產(chǎn)生菌，屬革蘭陽性放線菌，假諾卡菌亞目，假諾卡菌科，擬無枝菌酸菌屬[2]，歷史上曾將其歸為鏈霉菌屬，諾卡菌屬。近年來國內(nèi)許多學(xué)者通過對(duì)萬古霉素產(chǎn)生菌的反復(fù)自然分離、物理化學(xué)方法誘變和發(fā)酵條件優(yōu)化等途徑提高其產(chǎn)量[3-5]。

隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)等的發(fā)展，萬古霉素產(chǎn)生菌的分子信息越來越清晰，2014年，Xu等[6]對(duì)一株萬古霉素高產(chǎn)菌東方擬無枝酸菌HCCB10007 進(jìn)行了全基因組測(cè)序，就其基因序列與已報(bào)道的基因序列比對(duì)與分析，推測(cè)到有 10%的基因編碼調(diào)控蛋白，本研究從中選取了AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 六個(gè)基因進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，考察這六個(gè)調(diào)控基因?qū)θf古霉素合成的作用。AORI_1475 推測(cè)為 strR 型轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，可能與Amycolatopsisbalhimycina 中的 bbr（strR 型轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因）一樣起正調(diào)控作用[7]。AORI_1832、AORI_2956 和 AORI_3531 推測(cè)為 araC 型轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，可能也具有正調(diào)控作用，因?yàn)橛形墨I(xiàn)報(bào)道 araC 型的 rapG 正調(diào)控雷帕霉素（產(chǎn)生菌為鏈霉菌屬）的合成[8]。AORI_3398、AORI_7412 推測(cè)為 lysR 型調(diào)控基因，lysR 被認(rèn)為是全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，一般作為激活子或阻遏子起作用。微生物的次級(jí)代謝途徑受許多調(diào)控基因影響，通過對(duì)HCCB10007 中數(shù)個(gè)調(diào)控基因的研究，確定其對(duì)萬古霉素合成的影響，為提高萬古霉素產(chǎn)量，減少副產(chǎn)物的發(fā)酵工藝完善提供重要的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì) 粒 東方擬無枝酸菌HCCB10007、E.coli JM110 由上海來益生物藥物研發(fā)中心保藏，E.coli DH5α 購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒 pLYW2（pSET152含有 ermEp*啟動(dòng)子）由上海來益生物藥物研發(fā)中心提供，pMD19-Tsimple vector 購自日本 Takara 公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基、TSB 培養(yǎng)基、高氏1 號(hào)培養(yǎng)基、本氏培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基配方參見文獻(xiàn)[9]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 六個(gè)調(diào)控基因的調(diào)取及驗(yàn)證 參考文獻(xiàn)[10]提取 HCCB10007 基因組，采用 PCR 方法調(diào)取六個(gè)調(diào)控基因，所用引物見表 1，亞克隆后測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 調(diào)控基因過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用Nde I/Xba I 酶切調(diào)取到的調(diào)控基因和質(zhì)粒pLYW2，并用 T4 連接酶連接起來，構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒 pLYW2-1475、pLYW2-1832、pLYW2-2956、pLYW2-3531、pLYW2-3398、pLYW2-7412，構(gòu)建流程如圖 1 所示。

1.2.3 過表達(dá)菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證 文獻(xiàn)報(bào)道東方擬無枝酸菌存在限制-修飾（R-M）系統(tǒng)[11]，因此先將構(gòu)建好的過表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn) E.coli JM110，再將JM110 轉(zhuǎn)化子中的過表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入東方擬無枝酸菌 HCCB10007。

1.2.4 過表達(dá)菌株的發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物的驗(yàn)證 發(fā)酵培養(yǎng)條件參考文獻(xiàn)[12]。發(fā)酵液用 4 mol/L 的HCl 調(diào) pH 至 4～4.5，4 ℃ 高速離心，取上清液于 HPLC 檢測(cè)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用 PCR 擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 六個(gè)調(diào)控基因的調(diào)取及驗(yàn)證

PCR 方法成功提取到 HCCB10007 基因組，調(diào)取到的調(diào)控基因經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

2.2 調(diào)控基因過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

抽提 JM110 轉(zhuǎn)化子的過表達(dá)質(zhì)粒，Pst I 酶切驗(yàn)證，經(jīng)計(jì)算，pLYW2-1475、pLYW2-2956、pLYW2-3398、pLYW2-7412 應(yīng)切出約 0.8、2.6、3.5 kb 三條帶；LYW2-1832 應(yīng)切出約 0.8 和 2.6 kb兩條帶；pLYW2-3531 應(yīng)切出約 0.8、0.9、2.6 kb 三條帶。實(shí)際酶切結(jié)果如圖 2 所示，與理論值相符。

2.3 過表達(dá)菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證

挑取東方擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化子于 TSB 液體培養(yǎng)3 d，菌液 PCR 驗(yàn)證，由于調(diào)控基因本就來自HCCB10007，所以 PCR 驗(yàn)證時(shí)，設(shè)計(jì)引物將質(zhì)粒上紅霉素啟動(dòng)子基因 ermP 與調(diào)控基因一起PCR，得到的條帶應(yīng)約為 1.2 kb。實(shí)際 PCR 結(jié)果如圖 3 所示，由此可證實(shí)已獲得調(diào)控基因過表達(dá)菌株 HHT1475、HHT1832、HHT2956、HHT3531、HHT3398 和 HHT7412。

2.4 過表達(dá)菌株的發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物的驗(yàn)證

過表達(dá)菌株發(fā)酵 5 d，發(fā)酵液預(yù)處理后經(jīng)HPLC 分析。分析檢測(cè)結(jié)果如圖 4 所示，過表達(dá)菌株 HHT1475、HHT1832、HHT2956、HHT3531 的萬古霉素峰面積均高于 HCCB10007，特別是HHT1475 和 HHT1832 分別提高了 55% 和51%，HHT2956 和 HHT3531 分別提高了 18% 和29%，而 HHT3398 和 HHT7412 卻下調(diào)了萬古霉素的量，都降低了 12% 左右?？梢猿醪脚袛啵珹ORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531在萬古霉素合成中起正調(diào)控作用，而 AORI_3398、AORI_7412 起負(fù)調(diào)控作用，而且 AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 的調(diào)控作用不明顯。

圖1 過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程Figure 1 Construction of overexpression plasmids

圖2 過表達(dá)質(zhì)粒 Pst I 酶切驗(yàn)證Figure 2 Overexpression plasmids digestion by Pst I

圖3 過表達(dá)菌株 PCR 驗(yàn)證Figure 3 Mutants verification by PCR

圖4 HCCB10007 和過表達(dá)菌株的萬古霉素和無糖萬古霉素的產(chǎn)量Figure 4 Product of HCCB10007 and other overexpression strains

對(duì)其他發(fā)酵產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)菌株HHT1475 的無糖萬古霉素的產(chǎn)量約為 HCCB10007的 5 倍，HHT1832 約為 HCCB10007 的 7 倍，其他菌株與原始菌株 HCCB10007 相差不大。

3 討論

根據(jù)生物信息分析，萬古霉素基因簇位于基因組的核心區(qū)，共編碼 35 種酶（AORI_1471 到AORI_1505）。AORI_1475 推測(cè)為 strR 型調(diào)控基因，存在于萬古霉素合成基因簇內(nèi)[6]，為萬古霉素合成途徑特異性調(diào)控基因，這可能是 AORI_1475明顯提高萬古霉素產(chǎn)量的原因之一。作為可能的全局性調(diào)控基因，AORI_1832 位于萬古霉素合成基因簇外，但非?？拷铣纱兀云湟裁黠@上調(diào)了萬古霉素的產(chǎn)量。根據(jù)其他發(fā)酵產(chǎn)物量的變化，推測(cè)這兩個(gè)基因是通過調(diào)控萬古霉素的前體——無糖萬古霉素的合成來調(diào)控萬古霉素的產(chǎn)量，但具體怎樣調(diào)控還需進(jìn)一步研究。AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 的調(diào)控作用都比較弱，可能有兩個(gè)原因：①這四個(gè)基因距離萬古霉素基因簇比較遠(yuǎn)，可能是間接調(diào)節(jié)基因簇中的某個(gè)基因或者調(diào)節(jié)其他次級(jí)代謝途徑。②可能存在反饋調(diào)節(jié)。萬古霉素生物合成是由一個(gè)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控而成的，怎樣從調(diào)控基因入手，提高萬古霉素的生物合成，還需更詳細(xì)的研究。

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Effect of several regulatory genes on the biosynthesis of vancomycin

HAN Ting,WEI Wei,GE Mei,QIAN Xiu-ping

ObjectiveThe objective of this study was to obtain the mutant strains with high productivity of vancomycin through studying and transformation of regulatory genes in Amycolatopsisorientalis.MethodsSix putative regulatory genes AORI_1475,AORI_1832,AORI_2956,AORI_3531,AORI_3398 and AORI_7412 were selected based on DNA sequence analysis of HCCB10007 genome,and overexpressed in this study,respectively.ResultsThe yields of vancomycin of the first four overexpressed strains were increased by 55%,51%,18%,29% while the last two were reduced by about 12%.ConclusionAORI_1475,AORI_1832,AORI_2956 or AORI_3531 plays positively regulatory roles in vancomycin synthesis while AORI_3398 and AORI_7412 negatively regulate the synthesis.Furthermore,the regulatory role of AORI_2956,AORI_3531,AORI_3398 or AORI_7412 is weak.

Vancomycin; Regulatory elements,transcriptional; Amycolatopsisorientalis

QIAN Xiu-ping,Email:qianxp@sjtu.edu.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2012AA02A706）

200240 上海交通大學(xué)藥學(xué)院（韓婷、魏維、錢秀萍）；201203上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司（魏維、戈梅）

錢秀萍，Email：qianxp@sjtu.edu.cn

2016-11-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.005

方法選取經(jīng)基因組測(cè)序分析獲得的 6 個(gè)推測(cè)具有調(diào)控作用的基因：strR 型的 AORI_1475、araC 型的AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 和 lysR 型的 AORI_3398、AORI_7412 進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn) AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 的過表達(dá)分別將萬古霉素產(chǎn)量上調(diào)了 55%、51%、18%、29%，而 AORI_3398、AORI_7412 卻使萬古霉素產(chǎn)量下降了 12% 左右。

結(jié)論初步判斷 AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 對(duì)萬古霉素合成有正調(diào)控作用，而 AORI_3398、AORI_7412 對(duì)萬古霉素合成起負(fù)調(diào)控作用。

Author Affiliations:School of Pharmacy,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China (HAN Ting,WEI Wei,QIAN Xiu-ping); Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D,Shanghai 201203,China (WEI Wei,GE Mei)