申國明,王浩,秦勇

(安徽中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院,合肥 230038)

近年來, 國內(nèi)外許多學(xué)者對高位中樞核團(tuán)在胃運(yùn)動調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行了大量研究[1-3]?，F(xiàn)已證明,中樞的某些部位及核團(tuán)參與了針刺對胃運(yùn)動和胃電活動的調(diào)節(jié)。但高位中樞是否參與電針胃俞募穴對胃運(yùn)動的調(diào)節(jié)尚未見報道。我們利用電針刺激大鼠胃俞募穴,并設(shè)立空白對照組,通過觀察 c-fos在與胃運(yùn)動密切相關(guān)的中樞延髓 DVC中的表達(dá),探討電針胃俞募穴對胃運(yùn)動作用的中樞作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠,雌雄各半,體重220～250 g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(No.0001305)。置于室溫(25±2)℃,12/12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活,自由攝食、飲水。

1.2 主要實驗設(shè)備

Biopac多導(dǎo)生理記錄儀及Acqknowledge軟件分析系統(tǒng)(美國 BIOPAC公司),CS-Ⅵ型攤片烤片機(jī)、LeicaRM2016切片機(jī)、TS-12A生物組織自動脫水機(jī)、BM-Ⅸ生物組織包埋機(jī)(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司),DHG-924385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司),日本OLYMPUS生物顯微鏡等。

1.3 實驗器械及主要試劑

華佗牌 SDZ-Ⅳ型電子針療儀、針灸針,均由蘇州醫(yī)療用品廠有限公司提供;電阻應(yīng)變片,由中國航天空氣動力研究所提供;SABC免疫組化試劑盒、兔抗 Fos多克隆抗體等,均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 動物分組及應(yīng)力傳感器的埋置

選擇健康SD大鼠32只,稱重記錄后,隨機(jī)分為空白對照組(空白組)、針刺中脘組(中脘組)、針刺胃俞組(胃俞組)、針刺中脘配胃俞組(中脘＋胃俞組),每組8只。同等條件下飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1星期后,禁食12 h,自由飲水,用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,消毒條件下開腹,暴露胃體,距幽門0.3 cm處沿環(huán)形肌方向?qū)⒆灾茟?yīng)力傳感器縫貼于胃竇腹側(cè)面漿膜,導(dǎo)線經(jīng)皮下引至頸部固定。

1.5 取穴及針刺方法

根據(jù)華興幫《大鼠穴位圖譜》和體表的骨性標(biāo)志,胃俞取第十三胸椎下旁開5 mm,毫針直刺4～6 mm;中脘取臍上約20 mm,毫針直刺2 mm,采用平補(bǔ)平瀉手法。至針下出現(xiàn)沉緊感時,接 SDZ-Ⅳ型電子針療儀,電壓9 V,疏密波型,頻率20～100 Hz混頻刺激,電針左側(cè)胃俞、中脘,強(qiáng)度以局部皮膚肌肉輕微顫動為度。治療時間20 min,每日治療1次,連續(xù)治療7 d。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

針刺 1星期后,記錄各組大鼠胃運(yùn)動,記錄完畢,10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,快速剪開胸廓,捏住心臟,于心尖處剪一小口,插入灌注針頭到主動脈,止血鉗固定,剪開右心耳,快速滴入氯化鈉150 mL,再注入4%多聚甲醛300 mL,取腦,浸入固定液中,4℃放置48 h,脫水、包埋、切片。觀察DVC區(qū)c-fos表達(dá)情況。

1.6.1 胃運(yùn)動的記錄

大鼠禁食 12 h,自由飲水。將清醒動物置于特制鼠籠內(nèi),應(yīng)力傳感器導(dǎo)線接于Biopac多導(dǎo)生理記錄儀,通過生物信號記錄系統(tǒng)記錄胃運(yùn)動(胃運(yùn)動量程1 mv、濾波20 Hz)。應(yīng)用Acqknowledge軟件分析系統(tǒng),取胃運(yùn)動幅度的平均值及頻率作為觀察指標(biāo)。

1.6.2 免疫組化染色

切片脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育滅活內(nèi)源性酶,PBS液沖洗3次,熱修復(fù)抗原,自然冷卻;滴加5%BSA封閉液,室溫孵育 20 min;甩去多余液體,滴加 1:300稀釋度的兔抗c-fos(一抗),4℃過夜;室溫放置1 j,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗),37℃孵育20 min后PBS沖洗 3次;甩去 PBS液滴加試劑 SABC,37℃孵育20 min后PBS沖洗4次;甩去PBS滴加新鮮配制的DAB液,顯微鏡下觀察 5 min,適時終止反應(yīng)。蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察,以胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞。參考大鼠腦立體定位圖譜[4],在低倍鏡下明確DVC區(qū),在400倍光鏡下選取DVC區(qū)視野攝像,用Image-Pro Plus 5.1圖像處理與分析系統(tǒng)分析所選視野的表達(dá)強(qiáng)度(積分光密度)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針對大鼠胃運(yùn)動的影響

空白組和各電針組大鼠胃運(yùn)動收縮波以胃運(yùn)動幅度的平均值及頻率作為觀察指標(biāo)(詳見圖 1)。由表 1可見,電針各組胃竇運(yùn)動幅度明顯增加,與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);且中脘＋胃俞組胃運(yùn)動幅度增加更為顯著,與中脘組和胃俞組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。電針對各組大鼠胃運(yùn)動頻率影響不明顯,各組之間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 電針對各組大鼠胃運(yùn)動幅度及頻率的影響 (s)

表1 電針對各組大鼠胃運(yùn)動幅度及頻率的影響 (s)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與中脘＋胃俞組比較2)P＜0.01

空白組 8中脘組 8胃俞組 8中脘＋胃俞組 8 2.31±0.20 4.67±0.36 4.11±0.281)2) 4.60±0.43 4.01±0.381)2) 4.95±0.31 5.98±0.401) 4.85±0.38

2.2 各組大鼠DVC區(qū)c-fos表達(dá)比較

圖2、3可見,電針中脘、胃俞以及中脘＋胃俞均能上調(diào)大鼠腦DVC區(qū)c-fos的表達(dá),各電針組與空白組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);中脘＋胃俞組與中脘組和胃俞組比較,DVC區(qū)c-fos的表達(dá)顯著上調(diào),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中脘組和胃俞組之間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

迷走神經(jīng)運(yùn)動背核(dorsal motor nucleus of the vagus,DMV)和孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)是調(diào)節(jié)胃運(yùn)動和分泌的的中樞部分,兩者位置上緊鄰,功能上密不可分,共同構(gòu)成迷走背核復(fù)合體(dorsal vagal complex,DVC),發(fā)揮對胃運(yùn)動的調(diào)節(jié)。本研究利用電針胃俞募穴,以原癌基因 c-fos的表達(dá)為標(biāo)志,通過癌基因c-fos的表達(dá)產(chǎn)物Fos蛋白在與胃運(yùn)動密切相關(guān)的中樞延髓 DVC中的表達(dá)情況,來探討胃俞募配穴對胃運(yùn)動的調(diào)節(jié)作用及其中樞機(jī)制。原癌基因 c-fos廣泛存在于真核細(xì)胞基因組內(nèi),絕大多數(shù)正常細(xì)胞都有c-fos極低水平的表達(dá)[5]。c-fos表達(dá)可能是神經(jīng)元被刺激激活的一種標(biāo)志,可用以分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元受到外周刺激后的活動變化[6,7]。當(dāng)機(jī)體受到某種刺激時,在該刺激信息向中樞傳導(dǎo)的神經(jīng)通路上,相應(yīng)神經(jīng)元會出現(xiàn)Fos蛋白陽性表達(dá),用免疫組織化學(xué)的方法可以將其顯示出來。雖然我們應(yīng)用的是形態(tài)學(xué)的方法來顯示,但是某種程度上反映了一定的功能意義。

圖1 各組大鼠胃運(yùn)動收縮波

圖2 各組大鼠免疫組化染色顯示DVC區(qū)c-fos的表達(dá)(SABC,×400)

圖3 電針胃俞募穴對各組大鼠DVC區(qū)c-fos表達(dá)的影響

既往研究中,我們觀察到 DVC是針刺調(diào)整胃運(yùn)動和分泌的重要中樞部位[8]。有研究表明,在針刺調(diào)整胃運(yùn)動作用中,DMV和NTS神經(jīng)元被明顯激活[9]。在筆者實驗的免疫組化染色觀察中,電針胃俞募穴后大鼠的Fos蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物集中表達(dá)在延髓DVC中,且表達(dá)較空白對照組明顯增加,其中,中脘＋胃俞組Fos蛋白的表達(dá)較單獨(dú)針刺中脘和胃俞組增加明顯。這一實驗結(jié)果表明,電針胃俞募穴對中樞核團(tuán) DVC具有激活作用。與此同時,實驗還顯示在電針刺激胃俞募穴位的情況下,胃運(yùn)動的幅度明顯增加,且俞募配穴效果更顯著。因此提示胃俞募配穴對胃運(yùn)動的調(diào)節(jié)作用具有協(xié)同效應(yīng)。根據(jù)本實驗結(jié)果,我們可以初步推斷,電針胃俞募穴對胃運(yùn)動的調(diào)節(jié)作用可能是通過激活對胃運(yùn)動具有調(diào)節(jié)作用的中樞延髓DVC中的神經(jīng)元而實現(xiàn)的。

由上述的實驗結(jié)果,我們可以看出,電針胃俞募穴對胃運(yùn)動具有調(diào)節(jié)作用,而且這種調(diào)節(jié)作用的實現(xiàn)與中樞核團(tuán)DVC神經(jīng)元的激活有密切關(guān)系,表明DVC參與了胃俞募配穴對胃運(yùn)動的調(diào)節(jié)作用,初步揭示胃俞募配穴的中樞作用靶點(diǎn)。為進(jìn)一步證實胃俞募配穴作用的中樞靶點(diǎn),本項目組下一步將通過微透析技術(shù),探討DVC內(nèi)單胺類和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化,并摧毀中樞核團(tuán)DVC,觀察電針胃俞募穴對胃運(yùn)動的作用。

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[9]Liu JH, Yan J, Yi SX, et al. Effects of electroacupuncture on gastric myoelectric activity and substance P in the dorsal vagal complex of rats[J]. Neurosci lett, 2004,356(2):99-102.