李應(yīng)林，李 寧，李 冉，田 昕

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 附屬腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

CIK對人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP殺傷效應(yīng)及耐藥逆轉(zhuǎn)作用

李應(yīng)林，李 寧，李 冉，田 昕

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 附屬腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

目的探討CIK細(xì)胞對人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP體外殺傷效應(yīng)及逆轉(zhuǎn)作用。方法用MTT法分別檢測順鉑、CIK細(xì)胞、CIK聯(lián)合順鉑對人肺腺癌細(xì)胞A549及人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的殺傷活性，計(jì)算耐藥倍數(shù)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。結(jié)果①順鉑對人肺腺癌細(xì)胞A549及A549/DDP的50%殺傷濃度(IC50)分別為1.823g/mL、6.392 g/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP對順鉑的耐藥倍數(shù)(IR)為3.506。②CIK對人肺腺癌細(xì)胞A549及A549/DDP均有殺傷作用，其IC50分別7.657×105個(gè)細(xì)胞/mL、7.955×105個(gè)細(xì)胞/mL，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。③不同濃度的CIK細(xì)胞(1×105,2×105and3×105個(gè)/mL)與人肺腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，再加順鉑，其IC50值分別降至1.743g/mL、1.336g/mL、0.883g/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(FR)分別為(2.369、3.091、4.677)。結(jié)論①人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP較A549對順鉑有明顯的耐藥性。②CIK對人肺腺癌細(xì)胞A549及A549/DDP均有殺傷作用，殺傷效果在兩種細(xì)胞中無明顯差異。③無毒劑量CIK聯(lián)合順鉑作用于人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP，可以增加順鉑對耐藥細(xì)胞的殺傷活性。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)隨著CIK密度的增加而增大，說明CIK細(xì)胞能部分逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞A549/DDP對順鉑的耐藥性。

肺癌；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；耐藥；人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP；腫瘤免疫治療

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells，CIK)治療是近幾年發(fā)展起來的腫瘤免疫治療的全新策略，具有較高速度、較強(qiáng)殺瘤活性、對多種腫瘤細(xì)胞具有敏感殺傷活性、非MHC限制、并對正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)勢【1】。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，CIK細(xì)胞能殺傷腫瘤細(xì)胞，還能逆轉(zhuǎn)一些耐藥細(xì)胞的耐藥性，提高對化療藥物的敏感性。本研究擬在檢測CIK細(xì)胞對人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的殺傷效應(yīng)的同時(shí)計(jì)數(shù)耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，初步探討CIK細(xì)胞對人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

1 材料與方法

1.1 CIK細(xì)胞的制備 取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)IFN-γ，IL-2，抗CD3單抗等聯(lián)合誘導(dǎo)CIK細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞A549及人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d換液。待細(xì)胞生長鋪滿80%培養(yǎng)瓶底時(shí)，胰酶傳代，取指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將人肺腺癌細(xì)胞A549及人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP分為單純細(xì)胞培養(yǎng)對照組、單獨(dú)順鉑組、單獨(dú)CIK組、CIK聯(lián)合順鉑組。

1.4 MTT法分別檢測順鉑的殺傷活性、CIK殺傷活性、CIK聯(lián)合順鉑的殺傷活性。

1.4.1 MTT法檢測順鉑對人肺腺癌細(xì)胞A549和肺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的殺傷作用 將人肺腺癌細(xì)胞A549及人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP制成(2×104個(gè)細(xì)胞/mL)細(xì)胞懸液，以100 μl接種于96孔板中，加入100 μl不同濃度的順鉑，設(shè)調(diào)零組、對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用48h，加入MTT 20 μl，繼續(xù)避光培養(yǎng)4h，吸出上清液，加入DMSO150 μl，震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀(570 nm波長)檢測OD值。按公式計(jì)算細(xì)胞生長殺傷率(%)=1-(加藥組OD值-調(diào)零組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。計(jì)算出順鉑50%殺傷濃度(IC50)及耐藥倍數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50。

1.4.2 MTT法檢測CIK對A549和A549/DDP的殺傷活性 方法及分組同上，將不同細(xì)胞密度CIK 100μl 加入。用酶標(biāo)儀(570nm波長)檢測OD值。計(jì)算CIK 50%殺傷密度(IC50)和10%殺傷密度(IC10)。

1.4.3 MTT法檢測CIK聯(lián)合順鉑對A549和A549/DDP的殺傷效應(yīng) 方法和分組同上，選擇不同細(xì)胞密度的無毒劑量的CIK細(xì)胞與不同濃度的順鉑聯(lián)合使用，觀察其對A549和A549/DDP的殺傷活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對A549和A549/DDP的殺傷效應(yīng)及耐藥倍數(shù) MTT法分別檢測順鉑對A549及耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的殺傷作用，計(jì)算出順鉑對細(xì)胞A549的IC50=1.823g/mL；順鉑對耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的IC50=6.392g/mL(P<0.05)。耐藥倍數(shù)(IR)=3.506(見表1)。

表1 順鉑對A549和A549/DDP的殺傷效應(yīng)

2.2 CIK對A549和A549/DDP的殺傷效應(yīng) MTT法分別檢測CIK對A549及A549/DDP的殺傷效應(yīng)，結(jié)果顯示CIK對A549及A549/DDP均有殺傷，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，(見表2)。

2.3 CIK聯(lián)合順鉑對A549/DDP的殺傷效應(yīng)及逆轉(zhuǎn)耐藥作用 CIK(密度1×105個(gè)細(xì)胞/mL)聯(lián)合順鉑：IC50=1.743g/mL；CIK(密度2×105個(gè)細(xì)胞/mL)聯(lián)合順鉑：IC50=1.336g/mL；CIK(密度3×105個(gè)細(xì)胞/mL)聯(lián)合順鉑：IC50=0.883g/mL，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(FR)=IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑)/ IC50(加逆轉(zhuǎn)劑)分別為2.369、3.091、4.677(見表3)。

表2 CIK對A549及A549/DDP的殺傷效應(yīng)

表3 CIK(不同密度)聯(lián)合順鉑對A549/DDP的殺傷效應(yīng)

3 討論

肺癌作為最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率位居全球惡性腫瘤首位。治療手段包括手術(shù)、放療及化療為主的綜合治療，療效不盡如人意，經(jīng)過基礎(chǔ)和臨床研究，現(xiàn)以CIK治療為代表的生物治療已成為腫瘤治療的重要手段。

CIK細(xì)胞是一種非MHC限制、新型、高效的免疫活性細(xì)胞，在臨床得到了廣泛的應(yīng)用【2,3】，CIK細(xì)胞治療已成為腫瘤的第四大治療手段。

化療目前仍是肺癌的主要治療手段之一，其中順鉑是肺癌一線化療主要藥物，其耐藥的產(chǎn)生是導(dǎo)致肺癌治療失敗的主要原因之一，研究其耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)耐藥是臨床亟待解決的問題。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測CIK細(xì)胞對人肺腺癌細(xì)胞A549及人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的殺傷效應(yīng)，計(jì)算耐藥倍數(shù)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)對其逆轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示，A549/DDP所需順鉑劑量明顯高于A549。證實(shí)A549/DDP較A549而言，對順鉑明顯耐藥，此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道【4】結(jié)果相近。CIK對A549的IC50為7.657×105個(gè)細(xì)胞/mL，對A549/DDP的 IC50為7.995×105個(gè)細(xì)胞/mL，說明CIK對A549及A549/DDP均有殺傷作用，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)確定CIK對A549/DDP IC10=4.130×105個(gè)細(xì)胞/mL為CIK細(xì)胞作用A549/DDP的無毒劑量，以排除CIK細(xì)胞對肺腺癌細(xì)胞株的干擾，CIK聯(lián)合順鉑共同作用后，IC50值分別降至1.743μg/mL、1.336μg/mL、0.883μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明CIK聯(lián)合順鉑可以提高順鉑對A549/DDP的殺傷活性；計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(FR)分別為(2.369、3.091、4.677)，且逆轉(zhuǎn)倍數(shù)隨著CIK細(xì)胞密度的增加而增大。說明CIK細(xì)胞可部分逆轉(zhuǎn)A549/DDP對順鉑的耐藥性。其具體是通過何種機(jī)制逆轉(zhuǎn)其耐藥性的，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

【1】 Chan J K,Hamilton C A,Cheung M K,et al.Enhanced Kiling of primary ovarian cancer by retargeting autologous cytologous cytokine-induced killer cells with bispecific antibodies:a preclinical study【J】.Clin Cancer Res,2006,12(6):1859-1867.

【2】 Schmidt-Wolf I G,Lefterova P,Mehta B A,et al.Phenotypic characterization and identification of effector cells involved in tulmor cell recognition of cytokine-induced killer cells 【J】.Exp Hematol,1993,21(13):1673-1679.

【3】 Linn Y C,Hui K M.Cytokine-induced killer cells:NK-like cells with cytotolytic specificity against leukemia 【J】.Leuk Lymphoma,2003,44(9):1457-1462

【4】 蔡鵬，劉敘儀，韓復(fù)生，等.耐順鉑肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP的建立及耐藥機(jī)制【J】.中國腫瘤臨床,1995，22(8):582-587.

Studyofthecytotoxicandresistancereversaleffectsofcytokine-inducedkillercellsoncisplatin-resistanthumanlungadenocarcinomacelllineA549/DDP

Liyinglin,Lining,Liran,Tianxin

(The Affiliated Tumor Hospital，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China )

ObjectiveTo investigate the cytotoxic and resistance reversal effects of cytokine-induced killer cells (CIK) on cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP.MethodsThecytotoxicabilityofcisplatin,CIKcellsandcisplatincombinedwithCIKcellswasaccessedbyMTTassayfollowedbydetectingtheresistantindexandthereversalfold.ResultsThere was significant difference of the 50% inhibiting concentration (IC50) value between A549 and A549/DDP cells after cisplatin treatment.The resistant index of A549/DDP to cisplatin was 3.506.Also,CIK had inhibitory effects on A549 and A549/DDP cells and no significant difference was shown between these 2 cells.Furthermore,after A549/DDP cells were pretreated with CIK at the density of 1×105,2×105and 3×105cells/mL and then treated with cisplatin,there were significant difference of IC50 value among these 3 different cell density of CIK cells with the reversal fold of 2.369,3.091 and 4.677,respectively.Conclusion① A549/DDP cells are more resistant to cisplatin than A549 cells.② There was no significant difference of the inhibitory effects of CIK cells on A549 and A549/DDP cells.③ CIK cells combined with cisplatin could increase the cytotoxic ability of cisplatin on A549/DDP cells,suggesting that CIK cells partly reversed the resistance of A549/DDP to cisplatin.

lung cancer;cytokine-induced killer cells;drug resistance;cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP;tumor immunotherapy

R734

A

1000-2715(2012)05-0404-03

【收稿2012-05-23；修回2012-09-12】

(編輯：譚秀榮)