吳劍平，張 鑫，顧 欣，李丹妮，嚴(yán) 鳳，方絲蕓

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

牛乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為微生物提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，因此牛乳極易腐敗變質(zhì)。在牛乳中添加硫氰酸鈉后可有效抑菌、保鮮及延長(zhǎng)牛乳的保存期，但是，硫氰酸鈉也是毒害品，過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體造成危害，2008年12月衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第一批)》中明確規(guī)定硫氰酸鈉屬于違法添加物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1-2］，硫氰酸鈉作為硫代糖苷和生氰糖苷的代謝產(chǎn)物而普遍存在于生鮮牛乳中，十字花科類植物因?yàn)楦缓虼擒斩赡艹蔀榉侨藶樘砑拥纳r牛乳中硫氰酸鈉的主要來(lái)源之一。我國(guó)奶牛作為青飼料經(jīng)常飼喂的十字花科類植物包括花椰菜、卷心菜和一些甘藍(lán)菜的莖葉，油菜花屬于十字花科類蕓苔屬，其榨油后的菜籽餅也被常用作奶牛的蛋白補(bǔ)充飼料。因此，有必要研究飼喂十字花科類植物對(duì)生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的影響，以確定生鮮牛乳中非人為添加的硫氰酸鈉含量本底值。

目前已建立了高效液相色譜法與毛細(xì)管色譜法檢測(cè)牛奶中硫氰酸鈉含量，其中高效液相色譜法具有定量準(zhǔn)確、專一性強(qiáng)的特點(diǎn)［3-4］。該方法可適用于生鮮乳和巴氏滅菌成品乳，檢測(cè)限可達(dá)到0.2 mg/kg，定量范圍0.5 ～50 mg/kg，精確度 ＜10%，回收率＞90%。本研究通過(guò)該方法檢測(cè)生鮮牛乳中的硫氰酸鈉含量，通過(guò)對(duì)所得含量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到飼喂十字花科類植物對(duì)生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的影響規(guī)律。

1 儀器、材料與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜系統(tǒng)(2695-2998二極管陣列檢測(cè)器，Empower?色譜工作站);高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER);AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(B-490，BUCHI);十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Agela-ASB?C18，250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.2 材料與試藥 堿性氧化鋁SPE固相萃取柱(Agela-Cleanert? ，1000 mg ×6 mL);硫氰酸鈉(98.5%，ALDRICH);磷酸(分析純);三乙胺(分析純);乙睛(色譜純);甲醇(色譜純);正丙醇(分析純);去離子水(自制，電阻率＞10 MΩ·cm)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela-ASB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液∶甲醇=95∶5;柱溫30℃;流速0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm;進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，對(duì)空白、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，典型色譜圖如圖1所示。

圖1 典型色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件 精密量取樣品5.00 mL，置50 mL具塞離心管中，加入乙睛15 mL，密塞強(qiáng)烈振搖提取3 min后，至高速冷凍離心機(jī)中，4℃下8000 r/min離心3 min，小心取出全部上層清液，過(guò)堿性氧化鋁SPE柱，擠干，收集全部流出液于100 mL梨型瓶中，加入1 mL正丙醇，置60℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，精密加入1.00 mL磷酸鹽緩沖液，振蕩溶解后，置2 mL TIP離心管中，14000 r/min離心3 min脫脂后取水層溶液過(guò) 0.45 μm濾膜，待測(cè)。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選取與分組 選用健康的產(chǎn)奶乳牛20頭，產(chǎn)奶階段、產(chǎn)奶量、體重、胎次和年齡基本相近，分為空白組、卷心菜葉組、花椰菜葉組、2倍花椰菜葉組，每組各5頭，記錄每頭奶牛的編號(hào)，在開(kāi)始試驗(yàn)前停止飼喂含十字花科類植物的青飼料1個(gè)月。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼喂 各實(shí)驗(yàn)組除青飼料以外其他日糧相同，每日分三次定時(shí)飼喂(凌晨3：00，上午10：00，午后17：00)，其中精飼料每頭份每餐4 kg，配方為玉米48%、大麥10%、麩皮5%、玉米皮8%、豆粕9%、DDGS 15%、磷酸鈣2%、蘇打1.5%、碳酸鈣1.5%、食鹽1%;粗飼料每頭份每餐6 kg，主要為干牧草與干花生莖葉。青飼料依據(jù)組別各不相同，具體每餐每頭份飼喂情況如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每餐每頭份飼喂量表

2.3.3 試樣的采集 采用人工擠奶方式，每天進(jìn)行三次采奶，具體時(shí)間為每次投料飼喂之后。擠奶前對(duì)每個(gè)乳頭進(jìn)行消毒液消毒，并將消毒液擦拭干凈后進(jìn)行擠奶，棄去每個(gè)乳區(qū)的前20 mL乳液，每個(gè)乳頭分別采樣50 mL，混合均勻后進(jìn)行封裝。樣品使用保溫箱與冰袋進(jìn)行冷藏運(yùn)輸，采樣當(dāng)日進(jìn)行含量測(cè)定。

2.3.4 組內(nèi)個(gè)體差異的排除 對(duì)卷心菜葉組5頭牛分別進(jìn)行了連續(xù)5 d早中晚共計(jì)15次采樣測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)圖2。將每次采樣的均值作為基準(zhǔn)大部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)都落在其正負(fù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)，該結(jié)果說(shuō)明，該組參與試驗(yàn)的牛中除了有4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)未落在3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)的B4號(hào)牛都基本處于正常情況，沒(méi)有顯著的組間差異，其含量可以用除B4號(hào)牛之外的4頭牛所產(chǎn)生鮮乳的含量均值進(jìn)行分析，其他三組也以相同方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

圖2 組內(nèi)個(gè)體差異圖

2.3.5 日內(nèi)差異的排除 對(duì)B組飼喂卷心菜葉的連續(xù)5 d日間三次所采得奶樣進(jìn)行了含量測(cè)定，將其含量均值作圖，其結(jié)果見(jiàn)圖3。所得結(jié)果表明，同一天內(nèi)早中晚三次采樣的數(shù)據(jù)沒(méi)有超過(guò)同組當(dāng)日均值的正負(fù)3倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍，其差異并不顯著，而大部分情況下中午所采集的奶樣接近均值，因此可以取中午所采集點(diǎn)的數(shù)據(jù)表征當(dāng)日含量值。

圖3 日內(nèi)個(gè)體差異圖

2.3.6 4組加量飼喂試驗(yàn) 對(duì)所有進(jìn)行試驗(yàn)的4組奶牛停止飼喂青飼料一個(gè)月后，按照飼喂計(jì)劃開(kāi)始加量飼喂試驗(yàn)，取各組中午11：00飼喂之后所采生鮮乳進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)其中硫氰酸鈉含量，取沒(méi)有異常情況的樣品含量均值與標(biāo)準(zhǔn)差作圖，其結(jié)果見(jiàn)圖4。所得結(jié)果表明，通過(guò)比較每組當(dāng)日含量均值及其加減標(biāo)準(zhǔn)差后的范圍，飼喂十字花科類植物的B、C、D三組的乳中硫氰酸鈉含量顯著高于空白對(duì)照組;且其加減標(biāo)準(zhǔn)差后的范圍也不與之有重疊，三組中飼喂卷心菜葉的B組乳中硫氰酸鈉含量顯著低于飼喂花椰菜葉的C組與D組;C組與D組相比，D組乳中硫氰酸鈉含量的上升速度較快，但是在6 d以后兩組的乳中硫氰酸鈉含量趨于穩(wěn)定后，含量接近且其加減標(biāo)準(zhǔn)差的范圍重疊，因此其差異并不十分顯著。

圖4 4組加量飼喂試驗(yàn)(各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SD值)

2.3.7 體內(nèi)消除試驗(yàn) 飼喂8 d后飼喂花椰菜葉的C組與D組乳中的硫氰酸鈉含量趨于穩(wěn)定且其含量趨同。從第9天開(kāi)始對(duì)D組進(jìn)行停止飼喂花椰菜葉的體內(nèi)消除試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)繼續(xù)按時(shí)按量飼喂花椰菜葉的C組和空白對(duì)照組進(jìn)行采樣測(cè)定，所得結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)比較每日含量均值與其加減標(biāo)準(zhǔn)差的范圍，所得結(jié)果表明停止飼喂花椰菜葉3 d后，D組乳中硫氰酸鈉含量相比正常飼喂的C組有明顯下降，當(dāng)?shù)竭_(dá)5 d之后D組的含量均值到達(dá)第一個(gè)平臺(tái)期，當(dāng)?shù)竭_(dá)9 d后其含量又再次快速下降，到11 d又達(dá)到第二個(gè)平臺(tái)期，且其含量值與空白對(duì)照組A組的含量趨同。

圖5 消除規(guī)律圖(各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SD值)

3 討論

研究表明，十字花科類植物富含產(chǎn)生硫氰酸鹽的生氰糖苷和異硫糖苷，云苔屬類植物可達(dá)100 mg/kg，甘藍(lán)類植物也可達(dá)到 250 mg/kg［6］，但未有關(guān)于奶牛飼喂十字花科類植物對(duì)產(chǎn)奶中硫氰酸鈉含量影響的研究。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，南美洲個(gè)體奶牛間的生鮮乳中硫氰酸鈉含量在2.3～35 mg/kg范圍內(nèi)，其中未經(jīng)人為添加的散裝生鮮乳中硫氰酸鈉含量大約為8 mg/kg［7］，而一般采用乳過(guò)氧化酶體系進(jìn)行保鮮處理的生鮮乳中需要人為添加15 mg/kg以上。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中生鮮牛乳中非人為添加的硫氰酸鈉含量應(yīng)在2～15 mg/kg范圍內(nèi)，而飼喂十字花科類植物作為青飼料其每頓的飼喂量難以超過(guò)5 kg，試驗(yàn)中若再增加飼喂量，容易造成奶牛消化不良拉稀。通過(guò)對(duì)乳中硫氰酸鈉含量的安全評(píng)價(jià)可知［1］，乳中硫氰酸鈉含量在20 mg/kg以內(nèi)是安全的，因此從本文的研究結(jié)果看，按正常量飼喂十字花科類植物不會(huì)造成生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量超過(guò)正常水平。

在相同飼喂條件下，同組正常乳牛所分泌的乳中硫氰酸鈉含量應(yīng)符合隨機(jī)分布，因此其中個(gè)體含量落在其組內(nèi)均值的正負(fù)3倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)的概率應(yīng)大于99.73%［5］，因此認(rèn)為其中超出范圍的點(diǎn)偏離了組群的正常水平，判定為異常數(shù)據(jù)點(diǎn)，而當(dāng)某試驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)出現(xiàn)異常數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)該舍棄該動(dòng)物所提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。正是基于此原理對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了組內(nèi)個(gè)體差異和日內(nèi)差異的消除，確定了加量飼喂試驗(yàn)與體內(nèi)消除試驗(yàn)的數(shù)據(jù)采集方式。

通過(guò)加量飼喂試驗(yàn)可知，當(dāng)同樣處于停止飼喂青飼料的奶牛開(kāi)始飼喂十字花科類植物后其乳中硫氰酸鈉含量明顯高于仍然停喂青飼料的空白對(duì)照組，說(shuō)明飼喂十字花科類植物作為青飼料可使生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量提高;在飼喂量相同的情況下，花椰菜葉組的乳中硫氰酸鈉含量明顯高于卷心菜葉組，說(shuō)明飼喂不同類型的十字花科類植物對(duì)乳中硫氰酸鈉含量的影響不同，花椰菜葉相比卷心菜葉可以使乳中硫氰酸鈉含量提高更多;在同樣飼喂花椰菜葉的兩組中，以兩倍于平時(shí)飼喂量飼喂的D組乳中硫氰酸鈉含量升高較快，但是當(dāng)其含量升高至趨穩(wěn)后，兩者的含量均達(dá)到6～7 mg/kg，較為接近，說(shuō)明當(dāng)十字花科類植物的飼喂量達(dá)到一定水平后，再提高飼喂量對(duì)生鮮乳中硫氰酸鈉含量的提高幫助不大，推測(cè)可能是乳牛本身對(duì)硫代糖苷和生氰糖苷的吸收轉(zhuǎn)化率有一定的極限。另外，在停止飼喂一個(gè)月后的空白對(duì)照組在試驗(yàn)過(guò)程中始終能檢測(cè)到乳中硫氰酸鈉含量在1～2 mg/kg，而且在體內(nèi)消除實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中也能檢測(cè)到其始終維持在這一水平，說(shuō)明飼喂十字花科類植物不是影響生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的唯一因素。

通過(guò)體內(nèi)消除試驗(yàn)可知，當(dāng)乳中硫氰酸鈉含量趨穩(wěn)的飼喂組停止飼喂3 d后就能觀察到其乳中硫氰酸鈉含量的明顯下降，但到5 d時(shí)會(huì)下降到達(dá)第一個(gè)平臺(tái)期，推測(cè)可能與牛的反芻現(xiàn)象有關(guān)，其積存在瘤胃中的十字花科類植物通過(guò)反芻維持了其乳中硫氰酸鈉的含量，而當(dāng)達(dá)到9 d以后其乳中硫氰酸鈉含量再次下降，直至達(dá)到與空白對(duì)照組相近的水平，驗(yàn)證了本市天然生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的影響主要來(lái)自于十字花科類植物。

［1］顧 欣，黃士新，李丹妮，等.乳中硫氰酸鹽對(duì)人類健康的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［J］.中國(guó)獸藥雜志，2010，44(9)：45-49.

［2］李 鮮，陳昆松，張明方，等.十字花科類植物中的硫代葡萄糖苷的研究進(jìn)展［J］.園藝學(xué)報(bào)，2006，37(3)：15-17

［3］吳劍平，顧 欣，李丹妮，等.高效液相色譜法檢測(cè)牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2011，39(7)：44-46.

［4］吳劍平，顧 欣，李丹妮，等.毛細(xì)光電泳法檢測(cè)牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2012，40(3)：53-56.

［5］GB/T 4091-2001，常規(guī)控制圖的理解與實(shí)施［S］.

［6］WHO.Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants［R］.Geneva，1990.

［7］Ponec C.Reports of Field Studies from Cuba and Other South-American and Centeral-American coutries Personaled at the Technical Meeting on the Benefits and Potential Risks of the LP-system of Raw milk Preservation［R］.Rome，2005.