舒銀輝，黃文輝，饒清宜，鄭良益，漆世華，吳玉石，楊思誼，楊 雷，謝紅玲

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

豬偽狂犬病是一種由偽狂犬病毒引起的高死亡率的急性傳染病。豬偽狂犬病毒可侵害各種日齡階段的豬，病毒可引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎，哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、體溫升高、食欲下降、精神沉郁等不同程度臨床癥狀，且耐過后常出現(xiàn)生長阻滯。該病是危害我國規(guī)模養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疫病之一。豬偽狂犬病病毒的持續(xù)性感染和潛在的免疫抑制，對于豬的疾病防治工作帶來了很大困難。疫苗接種是防控豬偽狂犬病最主要、最經(jīng)濟的措施。本研究以豬偽狂犬病水包油佐劑滅活疫苗免疫兔和仔豬，并于免疫后一定時間攻擊強毒，比較疫苗對兔和仔豬的免疫效力，從而探討用實驗動物兔進行豬偽狂犬病滅活疫苗效力檢驗的質(zhì)控替代方法［1］。

1 材料與方法

1.1 疫苗 豬偽狂犬病滅活疫苗(HB-J株)為水包油佐劑滅活疫苗，每毫升疫苗中抗原含量為107.4 TCID50，疫 苗批 號 20100301、20100302 和20100303，由武漢中博生物股份有限公司制備。

1.2 效檢用強毒 豬偽狂犬病毒PRV HB-J株，病毒含量為 108.5TCID50/mL，對兔毒力為 106.0LD50/mL，由武漢中博生物股份有限公司鑒定與保存。

1.3 試驗動物及其攻毒發(fā)病判定標準 兔，2.5～3.0 kg，75只，普通級，購自武漢生物制品研究所。斷奶仔豬，21～28日齡，75頭，來自非免疫健康豬群，經(jīng)檢測PRV中和抗體效價均不高于1∶2，購于武漢新和畜牧養(yǎng)殖場。

仔豬攻毒發(fā)病判定標準：以下述(1)、(2)、(3)三項中出現(xiàn)任意兩項，即判定為發(fā)病。(1)有精神沉郁、和/或腹瀉、和/或食欲減退、和/或呼吸道癥狀等臨床表現(xiàn);(2)體溫≥40.5℃，且持續(xù)48 h以上;(3)相對日增重下降10%。

兔攻毒發(fā)病判定標準：發(fā)癢(啃咬接種部位)、死亡兩項中出現(xiàn)任意一項，即判定為發(fā)病。

1.4 血清中和抗體檢測 即采用血清中和試驗中的中和指數(shù)測定方法進行。將PRV HB-J株病毒液作10倍系列稀釋，分裝到兩列無菌試管中，第一列加等量正常血清(對照組)，第二列加待檢血清(試驗組)，混合均勻后于37℃中和作用1 h，然后分組每個稀釋度分別接種4孔已形成良好單層的BHK-21細胞，繼續(xù)置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察5 d。記錄每組BHK-21細胞的細胞病變數(shù)，分別計算兩組的組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)，按照公式(中和指數(shù)=試驗組TCID50/對照組TCID50)分別計算各待檢血清中和指數(shù)。

1.5 疫苗對兔免疫攻毒保護試驗 隨機抽取豬偽狂犬病滅活疫苗若干瓶，每批疫苗用兔25只，分為5組，每組5只，其中第1、2、3組為免疫組，第4、5組為對照組。第1、2、3組分別臀部皮下注射0.5、1.0、2.0 mL/只，第4 組為攻毒對照組(僅攻毒不免疫)，第5組為正常對照組(不免疫不攻毒)。免疫后28 d采血并分離血清，用血清中和試驗法(SN)檢測血清中和指數(shù)［2］，記錄檢測結(jié)果。免疫后28 d進行攻毒，攻毒劑量為10 LD50/只。攻毒后逐日觀察14 d，記錄各組兔臨床反應狀況，并計算保護率。

1.6 疫苗對斷奶仔豬免疫攻毒保護試驗 每批疫苗用斷奶仔豬25頭，分為5組，每組5頭，其中第1、2、3 組為免疫組，第 4、5 組為對照組。第 1、2、3組分別頸部肌肉注射 1.0、2.0、3.0 mL/頭，第 4 組為攻毒對照組(不免疫只攻毒)，第5組為正常對照組(不免疫不攻毒)。免疫后28 d采血并分離血清，用血清中和試驗法(SN)檢測血清中和指數(shù)，記錄檢測結(jié)果。免疫后28 d進行攻毒，攻毒劑量為每頭仔豬肌肉注射3 mL，并同時滴鼻3 mL。攻毒當日稱重每頭仔豬，攻毒21 d后再稱重每頭仔豬;攻毒后逐日觀察21 d，記錄各組動物臨床反應情況。根據(jù)仔豬發(fā)病判定標準計算保護率。

2 結(jié)果

2.1 疫苗對兔免疫與攻毒保護試驗結(jié)果 疫苗不同免疫劑量及其產(chǎn)生的抗體檢測值如表1所示。兔免疫后28 d血清抗體采用中和試驗法檢測中和指數(shù)，3批疫苗0.5 mL免疫組中和指數(shù)檢測值范圍為794～2188，離散度(以變異系數(shù)CV的百分率表示)分別為 36.12%、32.69%、21.15%;1.0 mL 免疫組中和指數(shù)范圍891～4677，離散度分別為75.02%、70.98%、50.01%;2.0 mL 免疫組中和指數(shù)范圍 2188～14791，離散度分別為 53.27%、40.65%、51.10%;對照組中和指數(shù)均為 1(表 1)。免疫28 d攻毒，3批疫苗0.5 mL免疫組攻毒保護率分別為60%、80%、80%，1.0 mL免疫組攻毒保護率分別為80%、80%、80%，2.0 mL免疫組攻毒保護率分別為100%、100%、100%。攻毒對照組兔均出現(xiàn)發(fā)癢、舔咬接種部位等臨床癥狀和臨床表現(xiàn)，并最終5/5死亡;正常對照組5只兔全部健活(表2)。

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2.2 疫苗對仔豬免疫與攻毒保護試驗結(jié)果 3批疫苗分別注射21～28日齡健康斷奶仔豬，免后28 d測定血清中和抗體，1.0 mL免疫組中和指數(shù)檢測值范圍229～269，離散度(以變異系數(shù)CV的百分率表示)分別為 4.58%、4.58%、6.38%;2.0 mL 免疫組中和指數(shù)范圍 398～589，離散度分別為14.42%、9.35%、9.18%，3.0 mL 免疫組中和指數(shù)范圍447～724，離散度幾何平均值分別為15.60%、20.84%、8.71%，對照組中和指數(shù)均為1(表1)。3批疫苗免疫后28 d攻毒，連續(xù)觀察21 d，1 mL免疫組部分斷奶仔豬在觀察期間出現(xiàn)厭食、體溫反應等不同程度發(fā)病癥狀，保護率分別為60%、60%、80%;2 mL和3 mL兩個免疫組斷奶仔豬在觀察期間無任何不良反應，保護率均為100%。而攻毒對照組5/5仔豬在攻毒后3 d均出現(xiàn)體溫反應(40.5 ～41.8 ℃)，且持續(xù)5 ～7 d，均伴有食欲減退現(xiàn)象，攻毒對照組發(fā)病率為100%(5/5)，正常對照組無任何不良臨床反應(表2)。

2.3 疫苗對兔與豬免疫攻毒保護試驗比較分析免疫后攻毒保護的對比試驗結(jié)果見表2。疫苗以不同劑量免疫兔與斷奶仔豬后，產(chǎn)生不同水平的血清抗體。以低劑量疫苗免疫兔與仔豬時，產(chǎn)生的血清抗體相對較低;以相對高劑量疫苗免疫兔與豬時，均產(chǎn)生較高水平的抗體。因此，免疫后相同對應時間，兔與豬血清抗體水平與疫苗免疫劑量呈現(xiàn)平行相關(guān)。

疫苗免疫28 d后攻毒，結(jié)合表1抗體檢測值，抗體值較低者獲得保護率相對較低，抗體值較高者獲得保護率相對較高，兔與豬的血清抗體水平與攻毒后獲得保護狀況呈現(xiàn)平行相關(guān)關(guān)系。

3 小結(jié)

3.1 疫苗對兔免疫效力試驗中，3種免疫劑量疫苗免疫后28 d產(chǎn)生的兔血清抗體中和指數(shù)0.5 mL免疫組中和指數(shù)為794～2188，1.0 mL免疫組中和指數(shù)為891～4677(每批疫苗的該免疫組中均有1只兔血清中和指數(shù)略低于1479)，2.0 mL免疫組中和指數(shù)為2188～14791，免疫組中血清抗體中和指數(shù)達到1479時可抵抗10 LD50劑量強毒的攻擊，不出現(xiàn)死亡或者其他異常臨床癥狀，0.5 mL免疫組保護率60% ～80%，1.0 mL免疫組保護率80%，2.0 mL免疫組保護率100%。試驗結(jié)果表明，血清中和指數(shù)在794～1258之間能獲得60%保護，中和指數(shù)≥1479時可獲得100%保護，而攻毒對照組兔全部死亡(血清中和指數(shù)為1)。試驗結(jié)果表明該疫苗能使兔產(chǎn)生良好的免疫應答反應［3］，且抗體產(chǎn)生水平高低與免疫劑量、攻毒保護呈現(xiàn)平行關(guān)系。

3.2 疫苗對仔豬免疫效力試驗中，1.0 mL免疫組中和指數(shù)為229～269，2.0 mL免疫組中和指數(shù)為398～589，3.0 mL免疫組中和指數(shù)為447～724;攻毒后連續(xù)觀察21 d，1 mL免疫組部分斷奶仔豬在觀察期間出現(xiàn)厭食、體溫反應等不同程度發(fā)病癥狀，保護率為60% ～80%;2 mL和3 mL兩個免疫組斷奶仔豬在觀察期間無任何不良反應，保護率均為100%;對照組均出現(xiàn)體溫升高(≥40.5℃)并持續(xù)3 d以上、食欲減退、生長速度減緩等臨床癥狀。各免疫組中血清抗體中和指數(shù)達到331時可抵抗強毒的攻擊，無體溫反應、食欲減退、生長速度減緩或其他異常臨床癥狀。試驗結(jié)果表明該疫苗能使豬產(chǎn)生良好的免疫應答反應，且抗體產(chǎn)生水平高低與免疫劑量、攻毒保護呈現(xiàn)平行關(guān)系。

綜上所述，豬偽狂犬病滅活疫苗(HB-J株)對兔和斷奶仔豬的免疫效力均良好，且疫苗對兔和斷奶仔豬的免疫效力呈現(xiàn)良好的平行關(guān)系。考慮到檢測成本以及動物福利等相關(guān)因素，在對豬偽狂犬病滅活疫苗(HB-J株)進行質(zhì)量檢驗時，可使用兔替代本動物(豬)進行效力檢驗。

［1］張 莉，丁伯良，王英珍，等.家兔校驗豬偽狂犬病滅活疫苗免疫效果的初步研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(5)：141-143.

［2］農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程(二○○○年版)［M］.北京：化學工業(yè)出版社.2000：446-447.

［3］舒銀輝，黃文輝，饒清宜，等.豬偽狂犬病不同佐劑滅活疫苗對兔免疫原性初探［J］.中國獸藥雜志，2011，45(12)：19-22.