朱長(zhǎng)太，鄭瑞娟，王 潔，胡忠義

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院，上海200433)

近年來(lái)隨著，耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)的出現(xiàn)和蔓延，使得結(jié)核防控更加困難[1,2]。建立可靠的結(jié)核耐藥檢測(cè)方法對(duì)于結(jié)核病的治療及防控?zé)o疑具有重要意義。由此，本文旨在建立一種結(jié)核分枝桿菌菌株耐多藥快速檢測(cè)方法，并評(píng)價(jià)其在臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 202株被BACTEC 960藥敏證實(shí)為MDR-TB臨床分離株為上海市肺科醫(yī)院2010年至2011年臨床確診的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性菌株。

1.1.2 主要儀器 PSQ96全自動(dòng)焦磷酸測(cè)序儀 (瑞典Biotage公司)、基因擴(kuò)增儀 (德國(guó)Eppendorf公司)、BACTEC MGIT 960檢測(cè)儀 (美國(guó) Dickinson公司)、Gene Genius全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng) (英國(guó)Syngene 公司)。

1.1.3 主要試劑 焦磷酸測(cè)序試劑盒、鏈親和素包被的磁珠均為瑞典PYROSEQUENCING AB公司產(chǎn)品，Bactec 960試劑購(gòu)自美國(guó)Dickinson公司，Taq酶等PCR擴(kuò)增體系試劑均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取保存于改良羅氏培養(yǎng)基的結(jié)核分枝桿菌，接種于Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3周后取1.0 ml液體培養(yǎng)物，80℃水浴保溫30 min滅活菌株，10 000 r/min，離心10 min棄上清，雙蒸水洗滌沉淀后將菌體沉淀重懸于 50μl裂解液中，50℃水浴 1 h，沸水浴 10 min，離心去上清。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 使用PSQ96MA系統(tǒng)自帶軟件Pyrosequencing TM Assay Design軟件，設(shè)計(jì)rpoB、katG基因PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物，設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。各耐藥基因PCR反應(yīng)體系為50μl：基因組模板2.0μl，4種脫氧核苷三磷酸的終濃度各為0.2 mmol/L，上、下游引物的終濃度各為0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)除退火溫度為：95℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，72℃ 30 s，共 50個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物固定后，純化單鏈模板，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。運(yùn)用Identifire分析軟件，將測(cè)序所得序列與MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株耐藥基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定結(jié)核桿菌臨床分離株各基因的突變類型和突變位置。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)MDR-TB的靈敏度及特異度。

1.2.4 質(zhì)量控制 MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv,ATCC27294)為本研究的質(zhì)控株。

2 結(jié)果

本研究中，我們確定表1中DNA序列作為rpoB、katG基因PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物來(lái)檢測(cè)結(jié)核菌利福平及異煙肼耐藥性。我們以焦磷酸測(cè)序同時(shí)檢測(cè)到rpoB基因及katG基因突變判讀為MDR-TB，結(jié)果顯示：202株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，焦磷酸測(cè)序檢測(cè)到MDR-TB共計(jì)154株；以BACTEC MGIT 960檢測(cè)結(jié)果為判讀標(biāo)準(zhǔn)，則焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)MDR靈敏度為72.8%[95%可信區(qū)間 (confidence interval:CI):66.3%～78.4%]，特異度為 90.0%(95%CI:80.1～95.1%)。 耐多藥結(jié)核分枝桿菌焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果表2。

表1 rpoB、katG基因PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物

表2 耐多藥結(jié)核分枝桿菌焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

3 討論

結(jié)核病耐藥是目前全球關(guān)注的一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題，已嚴(yán)重威脅到人類的健康。目前結(jié)核耐藥檢測(cè)常規(guī)方法多采用細(xì)菌學(xué)藥敏方法，該方法所需時(shí)間長(zhǎng)，不能及時(shí)為臨床提供用藥指導(dǎo)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一種新近發(fā)明的以檢測(cè)DNA合成過(guò)程中所產(chǎn)生的焦磷酸為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)[3,4]。焦磷酸測(cè)序技術(shù)實(shí)際上依靠四種酶(DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、螢光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)及兩種底物(APS和熒光素)完成。與Sanger法不同，焦磷酸測(cè)序技術(shù)依賴于核苷酸摻入中焦磷酸鹽的釋放，而非雙脫氧核苷三磷酸參與的鏈終止反應(yīng)[5]。目前，焦磷酸測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病原微生物快速鑒定、病毒與細(xì)菌分型、突變檢測(cè)及藥物基因組學(xué)等各個(gè)方面[6-9]。

本研究我們建立焦磷酸測(cè)序檢測(cè)異煙肼、利福平藥物耐藥性方法，BACTEC 960法以利福平及異煙肼同時(shí)耐藥判讀為MDR，而焦磷酸測(cè)序法以同時(shí)檢測(cè)到rpoB基因及katG基因突變判讀為MDR。在202株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，焦磷酸測(cè)序檢測(cè)到MDR-TB共計(jì)154株。以BACTEC960檢測(cè)結(jié)果為判讀標(biāo)準(zhǔn)，焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)MDR靈敏度為72.8%(95%CI:66.3%～78.4%)， 特異度為 90.0%(95%CI:80.1%～95.1%)。從研究結(jié)果來(lái)看，新確立的焦磷酸測(cè)序技術(shù)可檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性，具有較高的特異性與靈敏度。與Sanger法相比，焦磷酸測(cè)序技術(shù)具有高通量、低成本、檢測(cè)報(bào)告時(shí)間更短等優(yōu)勢(shì)[9]，由此我們認(rèn)為新建立的焦磷酸測(cè)序技術(shù)可作為耐多藥結(jié)核分枝桿菌藥敏實(shí)用的檢測(cè)工具，值得臨床推廣應(yīng)用。

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