楊海濤

Chelex－100法提取真核表達質(zhì)粒pcDNA3－HERG的應用體會

楊海濤

目的 探討Chelex－100法提取先天性長QT綜合征相關(guān)人類真核表達質(zhì)粒pcDNA3－HERG的可行性。方法 分別用Chelex－100法和堿裂解法提取pcDNA3－HERG質(zhì)粒，將環(huán)狀質(zhì)性DNA酶切為線性，0.8%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢測質(zhì)粒提取的有效性。結(jié)果 用Chelex－100法和堿裂解法提取的pcDNA3－HERG質(zhì)粒的OD(A260/A280)比較差異無統(tǒng)計學意義［分別為(1.8±0.6)，(1.9±0.4)，P＞0.05］，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢測均有特定的清晰條帶。結(jié)論 兩種方法均能提取純度較高的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，Chelex－100法簡便、省時，值得推廣。

pcDNA3－HERG; 真核表達質(zhì)粒質(zhì)粒;Chelex－100法;SDS－堿裂解法

先天性長QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是由于編碼心肌離子通道蛋白的基因突變導致心肌細胞膜離子通道功能障礙而引起的一組臨床綜合征。目前已發(fā)現(xiàn)了10個LQTS的相關(guān)基因，其中HERG基因突變引起編碼心臟延遲整流鉀電流功能障礙的長QT綜合征在中國較為常見。人類真核表達質(zhì)粒pcDNA3－HERG是研究該蛋白功能的有效工具。經(jīng)典的堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，適合于所有生物檢材，且提取的質(zhì)粒純度高，但操作繁瑣、復雜、費時，本文旨在探討一種新的操作步驟簡單、省時提取質(zhì)粒的方法，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 大腸桿菌質(zhì)粒來源 大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a:北京天為時代生物公司。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒pcDNA3－HERG:美國Wisconsin大學Anson BD博士惠贈，Chelex－100(Bio－Rad)，DL2000marker (北京天為時代生物公司)，堿裂解法質(zhì)粒小量制備試劑盒DP2602(北京百泰克)，固體培養(yǎng)基，限制性內(nèi)切酶 BamHI (購自Promega公司)，50×TAE，溴化乙錠(EB)，0.8%瓊脂糖凝膠，其余試劑均為進口及國產(chǎn)。

1.3 主要設(shè)備 小型DNA電泳儀及電泳槽(日本產(chǎn))、低溫離心機(Backman)、電磁爐(上海產(chǎn))，WP型紫外透射反射分析儀(上海醫(yī)療器械廠)、可見分光光度機(日本島津，UV－2401PC型)、全自動凝膠成像及分析系統(tǒng)(法國VL)、電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠)。

1.4 大腸桿菌的培養(yǎng) 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0 ml LB(含氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃、250 g振蕩培養(yǎng)過夜(約12～14 h)。

1.5 SDS－堿裂解法提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG 于1.5 mlEp管中加入1.5 ml大腸桿菌液，按照堿裂解法質(zhì)粒小量制備試劑盒DP2602說明書進行操作，最終用70 μl EB洗脫緩沖液將大腸桿菌質(zhì)粒DNA洗脫保存。

1.6 Chelex－100提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大腸桿菌液輕輕振蕩5 min，以求充分混勻，12 000 r/min離心2 min，去上清液，加200 μl 5%Chelex－100，56℃保溫30 min，劇烈振蕩5 s，沸水煮8 min，1000 r/min離心3 min，上清液即含用于酶切的質(zhì)粒DNA樣品。

1.7 質(zhì)粒DNA定量 在微量紫外分光光度計上分別測兩種不同方法提取質(zhì)粒DNA的吸光度(A，曾稱光密度OD)值。

1.8 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 將獲得的環(huán)狀質(zhì)粒用BamHI酶切為線性，反應體系如表1，快速混勻后，置37℃水浴1.5 h后，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 酶切反應體系(μl)

2 結(jié)果

2.1 同體積大腸桿菌液提取的質(zhì)粒 DNA獲得量(A260/ A280)分別為(1.8±0.6)、(1.9±0.4)，兩種方法比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 用兩種方法提取的質(zhì)粒DNA片段均為9.3 kp，且條帶清晰可見(圖1)。

3 討論

圖1 兩種方法提取的質(zhì)粒DNA電泳鑒定結(jié)果

質(zhì)粒pcDNA3－HERG和細胞內(nèi)DNA不同的是質(zhì)粒呈環(huán)狀，作為表達載體有其特有cDNA啟動子等其表達所需要的上游調(diào)節(jié)片斷。但其實質(zhì)仍然是DNA，因此，筆者嘗試用提取DNA的方法來提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG。

本文用經(jīng)典的堿裂解法和Chelex－100法分別提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG，然后把環(huán)狀的質(zhì)粒酶切成單鏈DNA，進行鑒定。結(jié)果顯示，在瓊脂糖電泳上都出現(xiàn)了特定區(qū)帶，而且Chelex100法也可成功提取純度較高的質(zhì)粒 pcDNA3－HERG。

經(jīng)典的堿裂解法的基本原理為:當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中，蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來，這是一種應用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，適合于所有生物檢材，且提取的質(zhì)粒純度高，但操作繁瑣、復雜、費時［1］。

Chelex－100是一種螯合型離子交換樹脂，由苯乙烯和苯乙二烯組成的聚合物，Chelex懸液在100℃煮沸時可使蛋白質(zhì)變性，大腸桿菌細胞壁破裂，質(zhì)粒從細胞中釋放［2］。Chelex與二價金屬離子螯合，從而避免樣品中存在的金屬離子在高溫和低離子強度溶液中作為催化劑使DNA降解，Chelex還能夠抑制核酸酶對DNA的消化作用，并在高溫、低離子強度條件下催化DNA的釋放。它已廣泛應用于微量血液、組織塊、精斑、骨骼及牙齒等法醫(yī)物證檢材［3］，這樣的處理過程既達到了分離提取DNA的目的，同時除去了一些影響酶切反應以及免疫化學反應的因子(如重金屬離子)，提高了質(zhì)粒pcDNA3－HERG在細菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等實驗過程中的利用率。該方法簡便快速，無腐蝕，提取過程始終在同一試管中進行，可減少DNA的損失，由于操作步驟簡單，減少了污染機會。Sepp等［4］研究認為，由于高溫對DNA有一定程度的降解作用，使得Chelex－100法提取的DNA片段在1000 bp以下，但是筆者的結(jié)果說明該方法可以成功提出大于1000 bp的質(zhì)粒。

［1］Sambrook J，F(xiàn)rist sch EF，Maniatist，et al．Molecular cloning－a laboratory manual［J］.2nd．Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989: 119－122．

［2］Stein A，Raoult D．A simple method for amplification of DNA from paraffin－embedded tissues［J］．Nucleic Acids Res，1992，20:5237．

［3］Walsh PS，Metzger DA，Higuchi R．Chelex－100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR－based typing from forensic material［J］．Biotechniques，1991，10(4):506－513．

［4］Sepp R，Szabo I，Uda H，et al．Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR［J］．J Clin Pathol，1994，47:318－323．

10.3969/j．issn.1674－4985.2012.06.093

450003河南省人民醫(yī)院

楊海濤

2011－12－19)

(本文編輯:連勝利)