孟超敏+李雪林+王麗崢+馬占強(qiáng)

摘 要：分別使用4種核酸染料對(duì)凝膠中質(zhì)粒DNA進(jìn)行染色，紫外凝膠成像儀下觀察和記錄結(jié)果，比較4種核酸染料對(duì)瓊脂糖凝膠中DNA的染色效果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，EB價(jià)格低廉，對(duì)含量為50ng以上的DNA著色效果最好，亮度較暗；而Gold view與EB相比染色效果無(wú)太大差別，但是亮度比EB稍亮；Sybr green在這4種核酸染料中亮度很明顯，且對(duì)含量為10ng以上的DNA就有熒光呈現(xiàn)；Ultra power對(duì)含量為5ng以上的DNA染色效果明顯，亮度最亮。由于EB有強(qiáng)致突變性，微毒，而后3種核酸染料基本無(wú)毒性，安全可靠，因此，本著經(jīng)濟(jì)、方便、可靠的原則，在實(shí)驗(yàn)室中用Gold view足以滿足一般需要；經(jīng)濟(jì)允許且在做熒光定量PCR、即時(shí)PCR時(shí)，最好選用Sybr green。

關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)教學(xué)；核酸染料；瓊脂糖；凝膠電泳

中圖分類號(hào) Q812；S336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）08-21-03

Application of Four Nucleic Acid Dyes in Experiment Instruction

Meng Chaomin et al.

（College of Agriculture，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

Abstract：DNA of plasmid was stained with four nucleic acid dyes.The staining results were investigated under UV transilluminator.The results show that，the EB price is low，the content is the best DNA coloring effect than 50NG，brightness is dark； and no significant difference between Gold view and EB dyeing effect，but a bit brighter brighter than EB； Sybr green in these four kinds of nucleic acid dye brightness obviously，and there are fluorescent presentation of the content of more than 10NG DNA； Ultra power on the content of 5ng or DNA staining effect is obvious，the most bright brightness.And because EB has strong mutagenicity，micro toxic； the latter three nucleic acid dye is nontoxic，safe and reliable.To sum up，in line with economic，convenient，reliable principle，in the laboratory using Gold view is sufficient to meet the general needs； and in the economy allows fluorescence Quantitative PCR，real-time PCR，the best selection of Sybr green.

Key words：Experiment instruction；Nucleic acid dye；Agarose；Gel electrophoresis

溴化乙錠（EB）是目前分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室核酸凝膠電泳中使用最普遍的染料，被廣泛用于觀察檢測(cè)核酸，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)[1-2]。但由于EB是一種強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性[3]，對(duì)實(shí)驗(yàn)者和周圍環(huán)境都有著較大的危害，因此，尋找可靠并更安全的核酸染料就成為了實(shí)驗(yàn)者迫切需要解決的問(wèn)題。本文對(duì)4種常見的核酸熒光染料Gold view、Sybr green、Ultra power、EB對(duì)瓊脂糖凝膠中DNA的染色效果、染色特性和可靠性進(jìn)行比較分析，從而為核酸熒光染料的選擇，以及保障實(shí)驗(yàn)人員的安全性、環(huán)境保護(hù)等方面提供參考。

1 主要材料、試劑與儀器

1.1 主要材料與試劑 含Pcambia1301型質(zhì)粒的大腸桿菌，溴化乙錠，Gold view，Sybr green，Ultra power，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 紫外可見分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），電子天平（BL610，北京賽多利斯天平有限公司），電泳儀（DYY-7型，北京市六一儀器廠），紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon1600型），高速冷凍離心機(jī)（3K15型）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 質(zhì)粒DNA的提取并進(jìn)行質(zhì)粒DNA純度和濃度測(cè)定 參照文獻(xiàn)[4]的方法小量提取質(zhì)粒，取出100μL的質(zhì)粒DNA，加入2 900μL的無(wú)菌蒸餾水，配成3mL的質(zhì)粒DNA。用蒸餾水作對(duì)照，測(cè)定樣品在260nm和280nm波長(zhǎng)下的光密度吸收值，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果，換算出OD260/OD280的比值。根據(jù)雙鏈DNA1OD260nm=50μg，計(jì)算出樣品DNA的濃度，計(jì)算公式為所測(cè)的OD260nm×50/10（μg/μL）。經(jīng)計(jì)算可得該次稀釋后的質(zhì)粒DNA濃度為10μg/mL。標(biāo)記為①號(hào)質(zhì)粒DNA（表1）。

2.2 質(zhì)粒DNA的稀釋 （1）用10μL量程的移液槍吸取5μl的①號(hào)質(zhì)粒DNA，再加入45μL的無(wú)菌蒸餾水，即成②號(hào)質(zhì)粒DNA，該DNA濃度為1μg/mL。（2）用10μL量程的移液槍吸取5μL的②號(hào)質(zhì)粒DNA，再加入45μL的無(wú)菌蒸餾水，即成③號(hào)質(zhì)粒DNA，該DNA濃度為0.1μg/mL。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA 灌制4塊濃度為0.8%瓊脂糖凝膠，當(dāng)瓊脂糖凝膠溶液冷卻至60℃分別在4份瓊脂糖凝膠溶液中加入2μL的EB、2μL的Gold view、2μL的Sybr green、2μL的Ultra power，輕輕混勻倒膠。在點(diǎn)樣板上混合DNA樣品和上樣緩沖液，使上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)達(dá)到1倍。分別用微量移液槍吸?。?0μL的DNA③、2μL的DNA②、5μL的DNA②、10μL的DNA②、2μL的DNA①、5μL的DNA①、10μL的DNA①與適量的上樣緩沖液混合。設(shè)置不同的DNA含量梯度為1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、50ng、100ng。并用10μL的移液槍將上述濃度的DNA樣品按次序加入2～8號(hào)點(diǎn)樣孔中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離。

表1 不同含量的DNA的吸光度

[濃度

（μg/mL）＼&吸光度＼&Ⅰ＼&Ⅱ＼&Ⅲ＼&平均＼&100＼&2.103＼&1.985＼&1.912＼&2.000＼&50＼&1.212＼&0.987＼&0.801＼&1.000＼&20＼&0.396＼&0.399＼&0.405＼&0.400＼&10＼&0.214＼&0.198＼&0.224＼&0.200＼&5＼&0.102＼&0.107＼&0.091＼&0.100＼&2＼&0.031＼&0.044＼&0.045＼&0.040＼&1＼&0.023＼&0.019＼&0.018＼&0.020＼&]

2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA 灌制4塊濃度為0.8%瓊脂糖凝膠，當(dāng)瓊脂糖凝膠溶液冷卻至60℃時(shí)，分別在4份瓊脂糖凝膠溶液中加入2μL的EB、2μL的Gold view、2μL的Sybr green、2μL的Ultra power，輕輕混勻倒膠。在點(diǎn)樣板上混合DNA樣品和上樣緩沖液，使上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)達(dá)到1倍。分別用微量移液槍吸取：10μL的DNA③、2μL的DNA②、5μL的DNA②、10μL的DNA②、2μL的DNA①、5μL的DNA①、10μL的DNA①與適量的上樣緩沖液混合。設(shè)置不同的DNA含量梯度為1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、50ng、100ng。并用10μL的移液槍將上述濃度的DNA樣品按次序加入2～8號(hào)點(diǎn)樣孔中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離。

3 結(jié)果與分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，將2組凝膠板分別置于紫外凝膠成像儀下，可觀察到4組膠板中的DNA樣品條帶（見圖1～圖4）。由圖1～圖4可以看出：Ultra power染色的條帶最亮，并且能檢測(cè)出5～100ng的DNA含量，且50ng/帶以上的樣品條帶清晰，有拖尾現(xiàn)象（如圖4）；Sybr green亮度次之，并且能檢測(cè)出含量為10ng以上的DNA條帶，但是在50ng/帶以上的樣品條帶清晰（如圖3）；Gold view的亮度再次之，對(duì)含量為50ng以上的DNA染色效果明顯，條帶清晰（如圖2）；EB的亮度最低，同樣對(duì)含量為50ng以上的DNA染色效果明顯（如圖1）；Gold view和Ultra power有少許的掃尾現(xiàn)象（如圖3，圖4）。根據(jù)各種不同的核酸染料在靈敏度、毒性、致癌性、熒光顯色等方面的綜合比較，3種新型核酸染料完全可以替代EB，本著經(jīng)濟(jì)、方便、可靠的原則，在普通實(shí)驗(yàn)室中用Gold view即可滿足一般實(shí)驗(yàn)需要。

[1][2][3][4][5][6][7]

圖1 EB的染色結(jié)果

注：1～7號(hào)點(diǎn)樣孔中DNA的含量分別為1、2、5、10、20、50、100ng/帶。

[1][2][3][4][5][6][7]

圖2 Gold view的染色結(jié)果

注：1～7號(hào)點(diǎn)樣孔中DNA的含量分別為1、2、5、10、20、50、100ng/帶。

[1][2][3][4][5][6][7]

圖3 Sybr green的染色結(jié)果

注：1～7號(hào)點(diǎn)樣孔中DNA的含量分別為1、2、5、10、20、50、100ng/帶。

[1][2][3][4][5][6][7]

圖4 Ultra power的染色結(jié)果

注：1～7號(hào)點(diǎn)樣孔中DNA的含量分別為1、2、5、10、20、50、100ng/帶。

4 結(jié)論與討論

EB價(jià)格最廉，但有毒性，有潛在致癌性，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)對(duì)含EB的溶液及其污染物進(jìn)行凈化處理再行棄置，以避免污染環(huán)境和危害人體健康，其與DNA結(jié)合在紫外燈下呈現(xiàn)紅色熒光。Gold view價(jià)格較低，毒性很低，靈敏度和EB的相當(dāng)，但不具有致癌性，在紫外燈下，Gold view染色使dsDNA呈現(xiàn)綠色熒光，而ssDNA呈紅色熒光，因此能較好的區(qū)分dsDNA和ssDNA。而Sybr green和Ultra power 的價(jià)格較高，對(duì)與一般的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)較為昂貴，但Sybr green和Ultra power的安全性更高，幾乎為無(wú)毒[5]。Ultra power是一種新型的花菁染料，不影響其他修飾酶作用，但該核酸染料對(duì)玻璃和非聚丙烯材料具有一定親和力，電泳時(shí)間也不宜超過(guò)2h，否則染料會(huì)從DNA/RNA上分離出來(lái)，會(huì)產(chǎn)生彌散裝條帶。Karlsen F等認(rèn)為[6-10]Sybr green是近幾年新推出的一種熒光核酸染料，在紫外燈下與dsDNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色熒光，與ssDNA結(jié)合呈現(xiàn)橘黃色熒光，但檢測(cè)ssDNA的靈敏度不高，效果不好，在熒光定量PCR、即時(shí)PCR方面應(yīng)用有著不可取代的優(yōu)點(diǎn)?？梢姡珿old view、Sybr green、Ultra power的3種染料的靈敏度均與EB基本相當(dāng)，甚至高于EB，而且這3種新型核酸染料基本對(duì)人體無(wú)害，不具有強(qiáng)致癌性。在向相同濃度的瓊脂糖凝膠中加入相同含量的4種核酸染料對(duì)相同的DNA樣品進(jìn)行電泳分析，可以看出4種核酸染料均能清晰檢測(cè)出濃度在50ng/帶的DNA樣品。

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（責(zé)編：張宏民）