張 忠，李科瑋，畢 陽(yáng)，王 義，任亞琳，畢 文

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

兩種兔耳草提取物的體外抑菌作用

張 忠，李科瑋，畢 陽(yáng)*，王 義，任亞琳，畢 文

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

短管兔耳草（Lagotis brevituba Maxim）和短穗兔耳草（Lagotis brachystachy Maxim）在傳統(tǒng)藏藥中具有抑菌消炎的功效。采用瓊脂孔擴(kuò)散法和96孔培養(yǎng)板對(duì)倍稀釋法測(cè)定了這兩種植物不同極性溶劑逐級(jí)提取物對(duì)4種采后真菌和4種腐敗細(xì)菌的體外抑菌率和最低抑制濃度。結(jié)果表明：在供試真菌中，短管兔耳草提取物對(duì)F.semitectum和P.expansum具有抑菌活性，短穗兔耳草提取物對(duì)P.expansum和A.alternate具有抑菌活性。兩種植物的提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑菌活性整體上較強(qiáng)，短管兔耳草提取物對(duì)S.aureus和P.fluorescence有抑菌活性，而短穗兔耳草提取物對(duì)S.aureus，E.coli，B. subtilis和P.fluorescence都有抑菌活性。提取物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度最低可達(dá)0.05g/mL。結(jié)論：這兩種植物的提取物具有較廣的體外抑菌譜和較強(qiáng)的抑菌活性。

兔耳草，抑菌活性，最低抑菌濃度，細(xì)菌，真菌

短穗兔耳草（Lagotis brachystachy Maxim）屬玄參科兔耳草屬植物，藏名直打薩曾，產(chǎn)于海拔2300～4100m的河灘草地、溝邊和樹(shù)林空地，廣泛分布于我國(guó)青藏高原地區(qū)。具有治肺胃淤血、肺結(jié)核、血熱性化膿癥等功效，為常用藏藥的上品[1-2]。有關(guān)該植物的抗食品腐敗菌的活性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。與其同屬的短管兔耳草（Lagotis brevituba Maxim）生長(zhǎng)于海拔3000～4850m的高山草甸及倒石堆、碎石帶上，藏名洪連，主要分布于青藏高原地區(qū)。全草入藥，具有解毒、消炎、止瀉等功效[3]。但對(duì)其抗菌方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。使用化學(xué)合成殺菌劑是目前用于防止疾病傳播、食品防腐和果蔬采后病害控制的首要措施[4]。病原菌對(duì)現(xiàn)有殺菌劑的抗性、環(huán)境污染以及因消費(fèi)不安全食品而造成的棘手的健康問(wèn)題和消費(fèi)者對(duì)食品品質(zhì)和安全性要求的日益提高，使得人們?cè)絹?lái)越努力尋找現(xiàn)有控制措施的互補(bǔ)或替代措施[5-11]。天然抗菌物質(zhì)既能延長(zhǎng)食品的可利用時(shí)間，同時(shí)能避免因腐敗微生物的酶系或代謝所產(chǎn)生的有關(guān)健康、安全、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和色澤等方面產(chǎn)生的問(wèn)題[12]，因此許多具有抗菌活性的植物提取物成為研究熱點(diǎn)[13-15]。本研究用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5種溶劑逐級(jí)分別提取兩種同屬藏藥植物短穗兔耳草和短管兔耳草，測(cè)定各種提取物對(duì)4種果蔬采后致病真菌以及4種常見(jiàn)食品腐敗細(xì)菌在體外條件下的抑制效果，為該兩種植物的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)，為天然抗菌劑的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試短穗兔耳草（Lagotis brachystachy Maxim）、短管兔耳草（Lagotis brevituba Maxim） 采自青海省化隆縣，由本校林學(xué)院植物分類學(xué)孫學(xué)剛教授鑒定，陰干、粉碎后用PE袋（17cm×12cm）包裝，4℃保存；金黃色葡萄糖球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescence）、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum） 由廣東微生物研究所購(gòu)得并在本院采后生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏；互格交鏈孢（Alternariaalternate）、半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）、粉紅單端孢（Trichothecium roseum） 由本院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病果實(shí)分離后保藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物制備 采用索氏抽提連續(xù)法進(jìn)行活性成分提取：各供試植物樣稱取50g粉末，用濾紙包好裝入索氏抽提器，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇進(jìn)行連續(xù)提取，各提取液過(guò)濾，并在35～45℃溫度范圍內(nèi)減壓濃縮至50mL，制備成1g/mL的原液，根據(jù)提取溶劑不同分別標(biāo)記為PE、CE、EE、AE和ME，放置4℃冰箱備用。

1.2.2 菌懸浮液制備

1.2.2.1 真菌懸浮液制備 參照Bi的方法[16]。取25℃下培養(yǎng)10d的帶菌PDA平皿一個(gè)，加入含0.05%Tween20的無(wú)菌水約10mL，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過(guò)濾，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，算出孢子懸浮液的濃度后，最后稀釋至所需濃度1×106cfu/mL。

1.2.2.2 細(xì)菌菌懸液制備 采用平板菌落計(jì)數(shù)法[17]。將供試細(xì)菌用接種環(huán)接入到50mL無(wú)菌水中，充分振蕩30min后二倍稀釋菌懸液，吸取標(biāo)記10-4、10-5、10-6的菌懸液各200μL，對(duì)號(hào)放入無(wú)菌平皿中，并用涂布器來(lái)回涂勻后轉(zhuǎn)入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，選擇最合適的平皿計(jì)數(shù)，并根據(jù)公式（每毫升中菌落形成單位（CFU/mL）=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5）計(jì)算出每毫升菌懸液中菌落的形成單位。

1.2.3 瓊脂孔擴(kuò)散法抑菌活性測(cè)定 參照Cakir的方法[18]并修改。將高壓滅菌的瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，霉菌用PDA培養(yǎng)基）趁液態(tài)倒入干燥滅菌的直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約為2mm，待培養(yǎng)基冷凝后，加入0.1mL菌懸液并加入少量二甲亞砜，均勻涂布平板，然后用無(wú)菌金屬打孔器（d=6mm）打成深2mm的小孔1個(gè)，用無(wú)菌牙簽除去孔內(nèi)瓊脂，并用移液槍吸取一滴瓊脂溶液封底。分別吸取不同的溶劑提取物0.2mL加入孔內(nèi)，并用各自的提取溶劑作空白對(duì)照（CK）。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。然后將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細(xì)菌置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，霉菌置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96h）。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，以平均值代表菌落的大小，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=（處理抑菌圈直徑-CK直徑）/處理抑菌圈直徑×100%

1.2.4 最低抑菌濃度測(cè)定（MIC） 采用Eloff法[19]并略做修改。采用5%（v/v）DMSO對(duì)各提取原液進(jìn)行系列二倍稀釋，96孔培養(yǎng)板紫外照射10min后，每孔加入100μL查氏培養(yǎng)基（真菌）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌），再加入100μL的系列稀釋液和20μL的菌懸液，各濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，最后一列作為對(duì)照，加入5%（v/v）DMSO。各孔加入0.5mg/mL的MTT 20μL作為指示劑，蓋好培養(yǎng)板并在28℃（細(xì)菌37℃）下培養(yǎng)24～48h，觀察指示劑顏色變化并記錄最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取物對(duì)真菌的抑制活性

短管兔耳草和短穗兔耳草各自的5種提取物對(duì)4種供試真菌的抑制活性表現(xiàn)出了較大的差異（圖1）。短管兔耳草除石油醚提取物以外的4種提取物至少對(duì)一種供試菌有抑制活性，且對(duì)敏感菌的抑制率在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到40%以上（IR1），其中F.semitectum對(duì)三種提取物敏感，P.expansum對(duì)兩種提取物敏感。短穗兔耳草的提取物對(duì)真菌的抑制活性整體上弱于短管兔耳草的提取物（IR2），體現(xiàn)在僅有兩種提取物表現(xiàn)出了抑菌活性且僅能對(duì)一種菌有效果。從兩種植物得到的弱極性的石油醚提取物均無(wú)抑菌活性；相同溶劑的兩類提取物抑菌譜沒(méi)有相似性。最低抑菌濃度是在實(shí)驗(yàn)條件下提取物發(fā)揮抑菌活性的最低濃度。通過(guò)96孔板MTT氧化變色的特性測(cè)得各種有效提取物對(duì)真菌的最低抑菌濃度為0.42g/mL（MIC1和MIC2），這一現(xiàn)象基本和這些抑菌物質(zhì)的真菌抑菌率相吻合，因?yàn)楦鞣N有效物質(zhì)的抑菌率整體上較接近（40%～54%）。另外，基于對(duì)倍稀釋的最低抑菌濃度測(cè)定方法所測(cè)得的僅為具體抑菌濃度的粗略值，所以盡管各抑菌物質(zhì)的抑菌率存在差異，但這一點(diǎn)未能在最低抑菌濃度上得到體現(xiàn)。較為具體的抑菌濃度可通過(guò)在粗略值兩側(cè)細(xì)化稀釋梯度而測(cè)得，也可通過(guò)Dose-Response關(guān)系通過(guò)回歸擬合而求得。

圖1 短管兔耳草（1）和短穗兔耳草（2）不同提取物對(duì)真菌的抑菌率（IR）和最低抑菌濃度（MIC）Fig.1 Inhibitory ratios（IR）and MIC of various extracts from Lagotis brevituba Maxim（1）and Lagotis brachystachy Maxim（2）to bioassay fungi

2.2 不同提取物對(duì)細(xì)菌的抑制活性

兩種植物的不同提取物對(duì)細(xì)菌的抑制活性整體上優(yōu)于對(duì)真菌的抑制活性（圖2）。短管兔耳草的5種提取物至少對(duì)一種供試菌有活性，且抑菌率基本上都高于40%（IR1），但是只對(duì)S.aureus和P.fluorescence有抑制活性。相比而言，短穗兔耳草除石油醚提取物外的4種提取物均有抑菌活性，每種供試菌至少對(duì)一種提取物敏感（IR2），且其乙酸乙酯、丙酮和甲醇三種溶劑的提取物對(duì)三種供試細(xì)菌有抑菌活性。從最低抑菌濃度來(lái)看，短管兔耳草提取物對(duì)兩種敏感菌的最低抑菌濃度表現(xiàn)出了很大的差異（MIC1），其中對(duì)S.aureus的最低抑菌濃度均為0.42g/mL，而對(duì)P. fluorescence的最低抑菌濃度均為0.05g/mL。短穗兔耳草對(duì)敏感菌的最低抑菌濃度根據(jù)提取物的不同表現(xiàn)出了較大的差異（MIC2）。整體上分析比較不同菌對(duì)各種提取物的敏感性，根據(jù)敏感提取物的種類數(shù)依次為P.fluorescence、S.aureus、B.subtilis和E.coli。關(guān)于短穗兔耳草提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌譜和抑菌活性結(jié)果與楊云裳[20]等的部分結(jié)果存在差異，由于許多因素會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中包括提取物的制備方法（如有效成分的揮發(fā)）、活性成分在植物不同器官的分布（如全株與部分器官的差異）和有效組分的富集程度等。

圖2 短管兔耳草（1）和短穗兔耳草（2）不同提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌率（IR）和最低抑菌濃度（MIC）Fig.2 Inhibitory ratios（IR）and MIC of various extracts from Lagotis brevituba Maxim（1）and Lagotis brachystachy Maxim（2）to bioassay bacteria

在一定實(shí)驗(yàn)條件下，提取物的最低抑菌濃度和抑菌率反映了該提取物抑菌特性的兩個(gè)方面：即最低的作用濃度和高于該值的某個(gè)濃度下的抑菌率。通常條件下，二者之間沒(méi)有必然的相關(guān)性。但在相似的抑菌動(dòng)力學(xué)關(guān)系下，特定濃度下的抑菌率和最低抑菌濃度之間呈反相關(guān)系。但是實(shí)驗(yàn)條件也會(huì)影響到這一關(guān)系的建立，其中最為關(guān)鍵的就是提取物在介質(zhì)中的分散性。因?yàn)檫@些有機(jī)溶劑提取物在水相介質(zhì)中的分散性是影響其活性的主要因素之一，而這種分散性受助溶劑濃度、共存分子的性質(zhì)等多種因素的影響。另外活性物質(zhì)劑量與活性強(qiáng)度之間通常存在S型關(guān)系?；钚詼y(cè)定時(shí)提取物的濃度范圍等會(huì)影響到抑菌率和最低抑菌濃度之間的關(guān)系。

對(duì)于這些體外具有較強(qiáng)抑菌活性的提取物質(zhì)，其體內(nèi)抑菌活性和進(jìn)一步分離純化有待進(jìn)行。這些天然活性提取物如果經(jīng)過(guò)純化或合理的配方，將可以用于食品腐敗菌的控制，另外也可作為合成新的抑菌劑的分子模板。

3 結(jié)論

短管兔耳草和短穗兔耳草在傳統(tǒng)藏藥中有消炎抗菌的用途，有機(jī)溶劑對(duì)其進(jìn)行極性梯度提取后獲得的提取物在體外具有不同的抑菌活性。在供試真菌中，短管兔耳草提取物對(duì)F.semitectum和P.expansum具有抑菌活性，短穗兔耳草提取物對(duì)P.expansum和A. alternate具有抑菌活性。兩種植物的提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑菌活性整體上較強(qiáng)，短管兔耳草提取物對(duì)S. aureus和P.fluorescence有抑菌活性，而短穗兔耳草提取物對(duì)S.aureus、E.coli、B.subtilis和P.fluorescence都有抑菌活性。提取物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度最低可達(dá)0.05g/mL。兩種植物的多種提取物具有較廣的抑菌譜和較強(qiáng)的抑菌活性；各種活性提取物的進(jìn)一步純化和相關(guān)抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1]中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志[M].西寧：青海人民出版社，1991：253.

[2]青海省生物研究所.青藏高原藥物圖鑒[M].西寧：青海人民出版社，1972：214.

[3]中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所.青海經(jīng)濟(jì)植物志[M].西寧：青海人民出版社，1987：519.

[4]Tripathi P，Dubey N K.Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables[J].Postharvest Biology and Technology，2004（3）：235-245.

[5]Ippolitoi A，Schena L，Pentimone I，et al.Control of postharvest rots of sweet cherries by pre-and postharvest applications of Aureobasidium pullulans in combination with calcium chloride or sodium bicarbonate[J].Postharvest Biology and Technology，2005（3）：245-252.

[6]Smilanick J L，Mansour M F，Gabler F M，et al.Control of citrus postharvest green mold and sour rot by potassium sorbate combined with heat and fungicides[J].Postharvest Biology and Technology，2008（2）：226-238.

[7]Droby S，Wisniewiski M，Macarisin D，et al.Twenty years of postharvest biocontrol research：is it time for a new paradigm[J]. Postharvest Biology and Technology，2009（2）：137-145.

[8]Sanzani S M，Nigro F，Mari M，et al.Innovation in the management of postharvest diseases of fresh fruits and vegetables [J].Arabic Journal of Plant Protection，2009（2）：240-244.

[9]Sharma R R，Singh D，Singh R.Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists：a review[J].Biological Control，2009（3）：205-221.

[10]Casals C，Teixido N，Vinas I，et al.Combination of hot water，Bacillus subtilis CPA-8 and sodium bicarbonate treatments to control postharvest brown rot on peaches and nectarines[J]. European Journal of Plant Pathology，2010（1）：51-63.

[11]Prusky D，Gullino M L.Postharvest pathology[M].The Netherlands：Springer，2010：119-135.

[12]Feng W，Zheng X.Essential oils to control Alternaria alternata in vitro and in vivo[J].Food Control，2007（9）：1126-1130.

[13]Lee S H，Chang K S，Su M S，et al.Effects of some Chinese medicinal plant extracts on five different fungi[J].Food Control，2007（12）：1547-1554.

[14]Verastegui A，Verde J，Garcia S，et al.Species of agave with antimicrobial activity against selected pathogenic bacteria and fungi[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008（7）：1249-1252.

[15]Santas J，Almajano M P，Carbo R.Antimicrobial and antioxidant activity of crude onion（Allium cepa L.）extracts[J]. International Journal of Food Science and Technology，2010（2）：403-409.

[16]Bi Y，Tian S P，Guo Y R，et al.Sodium silicate reduces postharvest decay on Hami melons：induced resistance and fungistatic effects[J].Plant Disease，2006（3）：279-283.

[17]沈萍，范秀容，李光武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

[18]Cakir A，Kordali S，Zengin H，et al.Composition and antifungal activity of essential oils isolated from Hypericum hyssopifolium and Hypericum heterophyllum[J].Flavour and Fragrance Journal，2004（1）：62-68.

[19]Eloff J N.A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria[J].Planta Medica，1998（8）：711-713.

[20]楊云裳，張應(yīng)鵬，馬興銘，等.藏藥短穗兔耳草有效部位的抑菌活性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006（10）：1884-1885.

Activity of extracts from two kinds of Lagotises against microorganisms in vitro

ZHANG Zhong，LI Ke-wei，BI Yang*，WANG Yi，REN Ya-lin，BI Wen
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Traditional Tibetan Medicine of Lagotis brachystachy Maxim and Lagotis brevituba Maxim imparted antimicrobial and antiinflammatory functions.To investigate the activity of extracts from these two plants against microorganisms in vitro，the agar well diffusion method and 96-well plate double dilution method were utilized to assess the inhibition ratios and minimum inhibitive concentration of their various extracts through successive extraction via solvents with gradient polarity.It showed that among bioassay fungi，F(xiàn).semitectum and P.expansum were inhibited by some extracts from Lagotis brevituba Maxim and P.expansum and A.alternata were inhibited by extracts from Lagotis brachystachy Maxim.Extracts from both botanical species exhibited stronger inhibition power against bacteria than fungi in general.L.brevituba Maxim extracts inhibited S.aureus and P.fluorescence growth.L.brachystachy Maxim had power against all four bioassay bacteria.The lowest minimum inhibitory concentration of extracts to bacteria was 0.05g/mL.It was concluded that extracts from the two species embodied with broader spectral range and stronger antimicrobial activity.

Lagotis；antimicrobial activity；minimum inhibitory concentration；bacteria；fungi

TS201.2

A

1002-0306（2012）09-0062-04

2011-08-26 *通訊聯(lián)系人

張忠（1977-），男，碩士，講師，主要從事天然抗菌活性物質(zhì)的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30671465）。