吳三林，劉 芳，賀 琴，劉 超，李書華

（樂山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，四川樂山614000）

雪蓮果粉對雙歧桿菌的體外促生長作用研究

吳三林，劉 芳，賀 琴，劉 超，李書華

（樂山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，四川樂山614000）

研究了雪蓮果粉對3種雙岐桿菌（長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌）體外生長的影響。結(jié)果表明，雪蓮果粉對3種雙歧桿菌的體外生長均有顯著的促進作用，優(yōu)于葡萄糖作碳源時的生長效果，同時對不同的雙歧桿菌的促進作用不完全一致。雪蓮果粉濃度為1.6%～2.4%（m/v）時長雙歧桿菌增殖效果最明顯，0.8%～1.6%（m/v）時短雙歧桿菌促生長效果明顯，1.2%～2.4%（m/v）兩歧雙歧桿菌促生長效果明顯。

雪蓮果，雙歧桿菌，低聚果糖，促生長

人體腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量的增多對維持人體身體健康十分重要。促使人體腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量增多的方法主要有兩種：一種是直接口服雙歧桿菌的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑；另一種是服用能促進雙歧桿菌在腸道內(nèi)增殖的物質(zhì)[1]?？诜p歧桿菌活菌劑受到許多條件的限制，尋求間接促進雙歧桿菌生長的方法和途徑成為研究者關(guān)注的方向。由于雙歧桿菌營養(yǎng)要求高，需要外源性生長因子，即雙歧桿菌促生長因子（Bifidus factor，BF）[2]。BF是能夠促進雙歧桿菌生長繁殖的一大類天然及合成物質(zhì)，通過促進雙歧桿菌生長繁殖表現(xiàn)其主要的生理功能，如：提高人體免疫力，抑制腸道有害菌生長等[3]。目前報道的BF中低聚糖及糖基化類物質(zhì)占主要部分。低聚糖（Oligosaccharide）又叫寡糖，它包括功能性低聚糖和普通低聚糖，其中功能性低聚糖不能被機體消化吸收，是公認的雙歧桿菌增殖因子[4]。作為BF——低聚果糖高含量的健康食品，雪蓮果越來越受人們的關(guān)注。雪蓮果（Smallanthus sonchifolius），又叫亞貢（Yacon）[5]，屬菊科（Compositae）向日葵屬（Helianthus L.）[6]。雪蓮果中含有豐富的低聚果糖，其低聚果糖含量為所有已知植物塊莖中最高，被稱為“低聚果糖之王”[6－8]。低聚糖占到雪蓮果干物質(zhì)的8.0%～61.9%[9]。低聚果糖不被人體利用，但能直接進入腸道被雙歧桿菌吸收，幫助雙歧桿菌在短時間內(nèi)迅速地增長[9]。目前，對雪蓮果的研究主要集中在其營養(yǎng)成分和食品加工方面，關(guān)于雪蓮果粉對雙歧桿菌的促生長作用，國內(nèi)研究極少。本實驗研究了不同濃度的雪蓮果粉對三種雙岐桿菌體外生長的影響情況，為雪蓮果的開發(fā)和綜合利用，促進腸道雙歧桿菌數(shù)量增多的途徑提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

雪蓮果 樂山市水果市場，低聚糖含量占干物質(zhì)的46%（用紫外分光光度法測出）；長雙歧桿菌（B. longum）、短雙歧桿菌（B.breve）、兩歧雙歧桿菌（B. bifidum） 廣東省微生物菌種保藏中心；雙歧桿菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基 參考郝林華[10]、Ryuichiro tanaka[11]的配方，加H2O定容至1L，pH7，116℃高壓滅菌30min；雙歧桿菌雪蓮果培養(yǎng)基 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制上略有變動，以不同劑量的雪蓮果粉代替葡萄糖作為培養(yǎng)基中的碳源，添加量分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、4%（m/v）；雙歧桿菌BS培養(yǎng)基[12－13]購買于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，用于雙歧桿菌的分離和計數(shù)。

DHG－9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科學(xué)儀器有限公司；電熱手提壓力蒸汽消毒器 中國上海；KD723型可見分光光度計 上?？频蔷軆x器有限公司；YQX－Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備雪蓮果干粉 將雪蓮果削皮，切成薄片，置于65℃干燥箱中烘干至恒重。將烘干的雪蓮果研磨成粉末，放在干燥器中備用。

1.2.2 配制稀釋液和培養(yǎng)基[14]。

1.2.3 雪蓮果粉對雙歧桿菌體外生長的影響 以雪蓮果粉培養(yǎng)基作為實驗組，基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組。用移液槍取0.1mL雙歧桿菌菌懸液置于分別含有雪蓮果粉0.1%，0.2%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%，2.4%，4.0%的5mL液體雪蓮果粉培養(yǎng)基試管中，并以液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。每一濃度設(shè)置3個重復(fù)，測定各培養(yǎng)液的吸光值OD550nm[10]和pH。用平板菌落計數(shù)法計數(shù)。觀察3種菌菌落生長情況[10]。

1.2.4 雙歧桿菌生長曲線的測定 通過上述實驗，確定雪蓮果粉作碳源在雙歧桿菌培養(yǎng)基中的最適添加量（根據(jù)實驗結(jié)果，選擇1.6%的雪蓮果粉濃度）。配制該雪蓮果粉含量的液體培養(yǎng)基，滅菌備用。以長雙歧桿菌為例，取7支裝有5mL液體培養(yǎng)基的試管，分別接種1mL長雙歧桿菌的菌懸液，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)。在相應(yīng)的培養(yǎng)時間取出長雙歧桿菌的培養(yǎng)液，立即測定，同時測定各管菌懸液的吸光值OD550nm。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，雙歧桿菌菌懸液在550nm的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。同時測定液體培養(yǎng)基pH的變化。短雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌作相同的培養(yǎng)，測定生長曲線。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，同時以雙歧桿菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組。

2 結(jié)果與討論

2.1 雪蓮果粉對雙歧桿菌體外生長的促進作用

雪蓮果粉對3種雙歧桿菌體外生長的影響見表1，雪蓮果粉培養(yǎng)基的3種雙歧桿菌與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組相比，菌落數(shù)有不同程度的增加，說明雪蓮果粉對雙歧桿菌的體外生長有促進作用。同時，從表1的結(jié)果表明，培養(yǎng)基中雪蓮果粉的含量并不是越高越好，不同雙歧桿菌生長的雪蓮果粉濃度不同。長雙歧桿菌在雪蓮果粉濃度為2.0%時生長效果最明顯，菌落數(shù)達到10.5×108CFU/mL，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的2.2倍。短雙歧桿菌在雪蓮果粉濃度為1.6%時增殖效果最明顯，菌落數(shù)達到11.6×108CFU/mL，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.9倍，濃度為4.0%時，短雙歧桿菌的生長受到抑制，菌落數(shù)反而比基礎(chǔ)培養(yǎng)基降低了5%，可能是高濃度的雪蓮果粉使得細菌細胞脫水，抑制了它的生長。兩歧雙歧桿菌在1.6%的雪蓮果粉濃度的培養(yǎng)基中增值效果最明顯，菌落數(shù)達到12.8×108CFU/mL，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.7倍，在濃度為4.0%時，菌落數(shù)比基礎(chǔ)培養(yǎng)基組下降了10%，兩歧雙歧桿菌的生長受到了抑制。綜合不同濃度的雪蓮果粉培養(yǎng)基對3種雙歧桿菌增殖效果，在1.6%的濃度時，增殖效果最明顯，長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌菌落數(shù)分為9.4×108CFU/mL，11.6×108CFU/mL和12.8×108CFU/mL，分別比基礎(chǔ)培養(yǎng)基增加95.8%、93.3%和70.7%。

表1 雪蓮果粉對雙歧桿菌體外生長的影響Table 1 Effects of yacon powder on the growth of Bifidobacteria in vitro

2.2 雙歧桿菌生長曲線的測定

圖1 長雙歧桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of B.longum

圖2 短雙歧桿菌生長曲線Fig.2 Growth curve of B.breve

3種雙歧桿菌液體培養(yǎng)后的生長變化（見圖1～圖3），3種雙歧桿菌在雪蓮果粉培養(yǎng)基中的生長繁殖的速度均快于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖速度，表現(xiàn)為雪蓮果粉液體培養(yǎng)基OD550nm值均大于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的，并且生長曲線表現(xiàn)為先升高，達到峰值后降低的變化趨勢。雪蓮果粉培養(yǎng)基組和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組均在經(jīng)過很短的適應(yīng)期后進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)12h后，雪蓮果粉培養(yǎng)基中的雙歧桿菌增殖速度明顯快于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，3種雙歧桿菌的液體培養(yǎng)基的OD550nm值均達到最大，長雙歧桿菌在雪蓮果粉培養(yǎng)基的OD550nm值達1.67，而基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的OD550nm值只有1.125，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基增加48.4%。短雙歧桿菌在雪蓮果培養(yǎng)的OD550nm值達1.631，而基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的OD550nm值只有1.085，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基增加50.3%。兩歧雙歧桿菌，雪蓮果粉培養(yǎng)基OD550nm值達1.424，而基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的OD550nm值只有1.118，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基增加27.4%。之后，雙歧桿菌的生長開始變慢，逐步進入衰亡期，但從圖中可見，雪蓮果粉培養(yǎng)基中雙歧桿菌進入衰亡期的速度比基礎(chǔ)培養(yǎng)基慢。從3種雙歧桿菌的生長曲線來看，在雪蓮果粉培養(yǎng)基中，長雙歧桿菌和短雙歧桿菌在對數(shù)期的增殖速度較兩歧雙歧桿菌的增殖速度快，說明雪蓮果粉對長雙歧桿菌和短雙歧桿菌的體外生長的促進作用較兩歧雙歧桿菌更明顯。

從表2中可以看出，雪蓮果培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH變化基本一致，表現(xiàn)為pH由7一直下降的趨勢。在培養(yǎng)12h時，雪蓮果培養(yǎng)基的pH下降程度低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，說明此時的雪蓮果粉培養(yǎng)基，緩沖能力較強，可以延遲pH下降的程度。進入穩(wěn)定期和衰亡期后，2種培養(yǎng)基的pH均下降到5.0左右。

圖3 兩歧雙歧桿菌生長曲線Fig.3 Growth curve of B.bifidum

表2 3種雙歧桿菌液體培養(yǎng)后的pH變化Table 2 pH changes of 3 kinds of Bifidobacteria in the liquid culture medium

3 結(jié)論

本實驗通過用雪蓮果粉來作為雙歧桿菌體外生長的碳源，培養(yǎng)了長雙歧桿菌，短雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌，研究結(jié)果表明雪蓮果粉對雙歧桿菌體外生長有顯著的促進作用，優(yōu)于葡糖糖作為培養(yǎng)基碳源時的生長效果。培養(yǎng)基中雪蓮果粉的添加量要適宜，同時不同雙歧桿菌生長所需的雪蓮果粉濃度不同。對長雙歧桿菌，1.6%～2.4%為最適劑量；對短雙歧桿菌，0.8%～1.6%為最適劑量；對兩歧雙歧桿菌，1.2%～2.4%為最適劑量；1.6%的濃度時，對3種菌的增殖效果都很明顯。過高濃度的雪蓮果粉對雙歧桿菌的生長有抑制作用。過低的雪蓮果粉濃度的促進效果不明顯，無法滿足雙歧桿菌生長過程所需的營養(yǎng)。3種雙歧桿菌的生長曲線表明，雪蓮果粉在對數(shù)期能使細菌顯著增殖，穩(wěn)定期時菌體數(shù)量大大高于葡萄糖作為碳源的雙歧桿菌數(shù)量。本實驗的結(jié)果進一步說明，雪蓮果粉能促進雙歧桿菌的生長與快速增殖。

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Study on the growth promoting effect of yacon powder on Bifidobacteria in vitro

WU San-lin，LIU Fang，HE Qin，LIU Chao，LI Shu-hua
（College of Chemistryamp;Life Sciences，Leshan Normal University，Leshan 614000，China）

In this experiment，yacon powder instead of glucose which could be used as acarbohydrate source in the culture medium.The growth of three Bifidobacteria：B.longum，B.breve，B.bifidum in vitro was studied.The results showed that yacon powder had significant effect to promote the growth of the three Bifidobacteria in vitro，the effect was better than that of glucose used as a carbohydrate source.Further more，promoting effect was different for different Bifidobacterium.The most significantly proliferation effect for B.longum，B.breve and B.bifidum were 1.6%～2.4%，0.8%～1.6%，1.2%～2.4%，respectively.

yacon；Bifidobacterium；smallanthus sonchifolius；fructo-oligosaccharide（FOS）growth promoting

TS201.3

A

1002－0306（2012）14－0176－03

2011－07－18

吳三林（1963－），男，本科，副教授，研究方向：植物生理生化。

四川省教育廳科研項目（10ZC018）。