徐榮榮，任廣鑫，王勝鵬，王玉霞，張正竹

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，安徽合肥230036）

樣品形態(tài)對綠茶品質(zhì)成分近紅外定量預(yù)測的影響

徐榮榮，任廣鑫，王勝鵬，王玉霞，張正竹*

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，安徽合肥230036）

對110份綠茶樣采用偏最小二乘法（PLS）建立水分、全氮量、粗纖維、水浸出物、茶多酚、咖啡堿和游離氨基酸的近紅外預(yù)測模型?？疾焱暾麡?、粉碎樣的近紅外光譜對該7種成分的建模效果，以及茶湯的近紅外光譜對水浸出物、茶多酚、咖啡堿和游離氨基酸的建模影響。研究顯示粉碎樣光譜建立的模型最優(yōu)，交叉驗證均方差（RMSECV）和預(yù)測均方差（RMSEP）均小于0.5，外部驗證的決定系數(shù)（R2）除粗纖維的為0.8598外，其余成分的R2均在0.9以上。茶湯光譜建立的模型效果不理想，其中咖啡堿和游離氨基酸的R2不超過0.5，相對分析誤差（RPD）小于2.5%。結(jié)果表明：綠茶進行粉碎處理比完整樣以及制備成茶湯建立的模型更為可靠，使用近紅外光譜技術(shù)可以快速檢測綠茶的7種成分。

綠茶，近紅外光譜，樣品形態(tài)，定量模型，快速分析

綠茶在我國產(chǎn)區(qū)分布最廣，產(chǎn)銷量最大，位居世界第一，其出口量占世界綠茶貿(mào)易總量的70%以上[1]。茶葉中含有水分、粗纖維、茶多酚、咖啡堿、氨基酸等多種成分，這些成分與茶葉品質(zhì)直接相關(guān)[1-2]。隨著茶葉產(chǎn)量和貿(mào)易量的增加，對茶葉品質(zhì)分析手段提出了更高的要求?，F(xiàn)有的茶葉成分分析方法大都利用不同化學(xué)方法（如比色法、HPLC法）對各成分進行逐一測定，操作復(fù)雜、費時費力、測試成本高且具破壞性，不能實現(xiàn)快速分析。因此迫切需要開發(fā)快速、簡便、準確的茶品質(zhì)成分分析的新方法。近紅外光譜分析技術(shù)因其無污染、成本低、速度快、多組分同時測定等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)產(chǎn)品、醫(yī)藥和石油等領(lǐng)域[3-11]。國內(nèi)外大量的研究表明，利用近紅外光譜技術(shù)可以定量分析茶葉中的水分、茶多酚、咖啡堿、氨基酸等內(nèi)含物的含量[12-20]。前人研究大都選擇完整茶葉或粉碎樣品中某一種樣品形態(tài)建立模型，而采用不同形態(tài)樣品（完整茶葉、粉碎樣、茶湯）進行的研究鮮有報道。樣品是否經(jīng)過前處理，是液態(tài)還是固態(tài)等，對近紅外檢測結(jié)果影響很大[21-22]。本研究對綠茶進行近紅外光譜解析，采用偏最小二乘法建立綠茶中7種成分的預(yù)測模型，旨在探討完整茶樣、粉碎樣和茶湯三種樣品形態(tài)對模型預(yù)測效果的影響，以期為綠茶品質(zhì)檢測提供一種快速、科學(xué)、準確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 收集當年生產(chǎn)的高、中、低檔綠茶樣品110個，產(chǎn)地主要是安徽、江蘇、浙江等綠茶主產(chǎn)區(qū)，樣品種類包括毛峰、瓜片、黃芽、猴魁、龍井、碧螺春等名優(yōu)茶以及大宗炒青綠茶等。每個樣品分兩份，各約35g，一份不經(jīng)處理，一份用JFSD-100型粉碎機磨碎，過40目篩，所有樣品密封4℃冷藏備用；茶湯制備稱取3g粉碎樣（3份）置于500mL錐形瓶中，加入煮沸蒸餾水450mL，沸水浴中浸提45min，趁熱抽濾，殘渣用少量蒸餾水洗3次，將濾液移入500mL容量瓶中，冷卻后用蒸餾水定容，搖勻備用。

MPA傅里葉變換近紅外光譜儀 德國布魯克光學(xué)儀器公司。

1.2 近紅外光譜采集

采用MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，掃描譜區(qū)范圍800～2500nm（12500～4000cm-1），工作溫度為25℃，分辨率8cm-1，PbS檢測器。采用97mm金屬樣品杯配套自動旋轉(zhuǎn)樣品臺采集完整樣與粉碎樣的漫反射光譜，掃描次數(shù)32次，完成一次光譜采集約32s；通過液體專用樣品池采集茶湯的透射光譜，掃描次數(shù)16次，完成一次光譜采集約16s。每個樣品均裝樣三次，取平均光譜作為分析光譜。

1.3 化學(xué)測定

水分采用120℃烘箱法，依據(jù)GB/T 8304-2002測定；水浸出物采用恒重法，依據(jù)GB/T 8305-2002測定；茶多酚采用福林酚法，依據(jù)GB/T 8313-2008測定；游離氨基酸采用茚三酮比色法，依據(jù)GB/T 8314-2002測定；咖啡堿采用紫外分光光度法，依據(jù)GB/T 8313-2002測定；粗纖維利用CXC-06型纖維素分析儀器，依據(jù)GB/T 8310-2002測定；全氮量采用GB/T 5009.5-1985方法測定。每個樣品平行測定3次，取平均值為樣品的化學(xué)值。

1.4 模型的建立與評價

為消除高頻隨機噪聲、基線漂移和樣品厚度不均等影響，對采集的光譜數(shù)據(jù)進行平滑、導(dǎo)數(shù)處理、多元散射校正和歸一化等[23-24]必要的預(yù)處理。采用偏最小二乘法（PLS）作為建立模型的化學(xué)計量學(xué)方法，通過OPUS-QUANT2定量分析軟件完成光譜數(shù)據(jù)的處理、模型的建立和驗證。對建模樣品采用留一法進行內(nèi)部交叉驗證建立模型，用剩余樣品對模型進行外部驗證，以交叉驗證均方差（RMSECV）、預(yù)測均方差（RMSEP）、決定系數(shù)（R2）和相對分析誤差（RPD）作為評價模型預(yù)測效果的指標。R2越大，RMSECV、RMSEP越小，建立的模型越可靠。當3%≤RPD＜10%時，表明模型效果良好，預(yù)測精度高，可用于實際檢驗；如果2.5%＜RPD＜3%，模型預(yù)測效果一般，模型有待進一步優(yōu)化；如果RPD≤2.5%，則說明難以用于定量分析[25-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠茶近紅外光譜測量結(jié)果

綠茶中有機物的含氫基團（C-H，O-H，N-H）振動的倍頻與合頻的吸收構(gòu)成了近紅外光譜的核心部分。圖1中a、b、c分別是110個綠茶完整樣、粉碎樣和茶湯樣的平均光譜圖。從圖1可以看出，完整樣與粉碎樣的光譜曲線大致呈現(xiàn)3個波段形狀。第一個波段（12500～7000cm-1）是這些基團振動的高級倍頻區(qū)，譜帶較弱；第二個波段（7000～5200cm-1）和第三個波段（5200～4000cm-1）是這些基團振動的一級倍頻和合頻譜區(qū)，信息較強[27]。水分子中的O-H在近紅外譜區(qū)有兩個特征譜帶：1940nm（5155cm-1）的組合頻和1440nm（6944cm-1）伸縮振動的一級倍頻。這兩個特征吸收會干擾非水分的測定。圖1中可以看出，茶湯中的水分對近紅外光譜的吸收峰影響較大，為防止水分的干擾，在篩選波長范圍時應(yīng)盡量避開水分特征吸收區(qū)[28]。

圖1 綠茶完整樣（a）、粉碎樣（b）的近紅外漫反射光譜和茶湯（c）的透射光譜圖Fig.1 Near infrared diffuse reflectance spectra of integrated（a）and crushed（b）samples and transmission spectra of green tea soup（c）

2.2 異常樣品的剔除與樣品集的劃分

建立模型時會出現(xiàn)樣品組分測定值或光譜數(shù)據(jù)出現(xiàn)較大誤差的情況，該類異常樣品的存在會影響模型預(yù)測的準確性，需要從樣品集中剔除。剔除異常樣品的方法是采用PLS法和留一法通過內(nèi)部交叉驗證對全部樣品光譜進行異常值檢驗，馬氏距離大于3.0的樣品被視為異常樣品[29]，均被剔除。將非異常樣品按各成分的含量大小排列后按隔二選一法劃分為校正集和檢驗集，樣品分集結(jié)果以及含量分布見表1。

2.3 不同樣品形態(tài)的PLS模型的建立與評價

對完整樣、粉碎和茶湯三類樣品形態(tài)的近紅外光譜，使用校正集樣品內(nèi)部交叉驗證建立了各成分的PLS模型，結(jié)果見表2。從表2可以看出，不同樣品形態(tài)的近紅外光譜建立的各成分模型的結(jié)果有明顯差異，由粉碎樣建立的7種成分的模型，R2、RPD值均比其完整樣的模型高，RMSECV??；用茶湯光譜建立的水浸出物、茶多酚、咖啡堿和游離氨基酸的模型，RMSECV較大，R2、RPD值較小，其中水浸出物和茶多酚茶湯模型的R2為0.8473、0.7679，咖啡堿和游離氨基酸茶湯模型R2不超過0.5，RPD值小于2.5%，預(yù)測效果遠不如固體光譜建立的模型。R2越接近1，RMSECV越小，表明模型對樣品的預(yù)測結(jié)果越準確，模型的可靠性越高。因此由表2可知粉碎樣光譜建立的模型效果最好。

表1 樣品分集結(jié)果以及各成分的含量分布Table 1 The diversity results of samples and the contents distribution of measured values for each component

表2 不同樣品形態(tài)下建立的PLS模型交叉驗證的統(tǒng)計數(shù)據(jù)Table 2 Statistical values of cross－validation models by PLS with different sample shape

表3 最優(yōu)模型的處理方法Table 3 Treatments of optimal models

使用粉碎樣光譜，利用軟件中的自動優(yōu)化功能選擇最佳的光譜預(yù)處理方法、譜區(qū)范圍和主成分數(shù)，得到所有成分模型的最佳處理方法和預(yù)測結(jié)果見表3、表4。從表3可以看出，光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理，當主成分為8，選擇波數(shù)范圍在12493.1～4597.7cm－1時，建立的水分模型最優(yōu)；光譜經(jīng)矢量歸一化處理，分別選擇主成分數(shù)為11和10時，水浸出物和全氮量模型建立的效果最好，對應(yīng)的最佳譜區(qū)分別是12493.1～6098.1、5450.1～4246.7和6101.9～4246.7cm－1；粗纖維模型在7502～5446.2、4424.1～4246.7cm－1，光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+MSC處理，主成分為10時效果最好；光譜經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)+MSC和多元散射校正處理，主成分數(shù)都為9時，分別選擇譜區(qū)在6101.9～5446.2和7502～5446.2、4424.1～4246.7cm－1時，建立的茶多酚和咖啡堿模型最優(yōu)；光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化，在7502～6800.1、5450.1～4246.7cm－1，主成分數(shù)為13時，游離氨基酸模型效果最好。

表4 近紅外模型內(nèi)部交叉驗證與外部驗證的結(jié)果Table 4 The results of models in cross validation and external validation

由表4可知，水分、全氮量、粗纖維、水浸出物、茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸內(nèi)部交叉驗證的R2分別為0.9862、0.9183、0.8707、0.9367、0.9334、0.9609、0.9201，RMSECV分別為0.182、0.098、0.394、0.452、0.366、0.078、0.193。除粗纖維外，其他6種成分的模型的R2均在0.90以上，具有較好的相關(guān)性，RPD均大于3%，RMSECV均小于0.5，說明模型的預(yù)測精度較高。其中水分和咖啡堿模型效果最好，全氮量和粗纖維模型預(yù)測效果稍差，游離氨基酸的主成分數(shù)偏大，建立的模型較復(fù)雜，有待進一步優(yōu)化。

2.4 模型效果的驗證

對于建立的定量模型，需要用外部驗證的方法進一步檢驗其準確性和實用性。對檢驗集樣品的水分、全氮量、粗纖維、水浸出物、茶多酚、咖啡堿以及游離氨基酸含量進行預(yù)測，近紅外模型預(yù)測值與化學(xué)測定值之間的相關(guān)關(guān)系見圖2，驗證結(jié)果見表4。從表4可以看出，粗纖維模型預(yù)測決定系數(shù)R2為0.8598，RPD為2.68%，只能用于粗略檢測，模型有待進一步優(yōu)化。其余成分的R2均在0.91以上，表明該6種成分的模型預(yù)測值與化學(xué)值有很好的相關(guān)性；RPD值均在3.5%以上，說明模型穩(wěn)定性和預(yù)測能力好，可以用于實際檢測。其中水分和咖啡堿的預(yù)測決定系數(shù)R2大于0.95，RPD超過5%，模型的預(yù)測性能最好。

3 結(jié)論與討論

通過對綠茶完整樣、粉碎樣和茶湯的近紅外光譜進行PLS建模，粉碎樣建立的模型除粗纖維RPD為2.68%外，其余成分的RPD均大于3%，預(yù)測穩(wěn)定性和精度較高，可以實現(xiàn)綠茶中7種成分含量的快速測定。使用透射方式獲得的茶湯光譜建立模型效果較差，不能用于實際檢測，可能是由于浸提出來的茶湯中水分占大部分，水分的強吸收信號會使光譜出現(xiàn)吸收峰飽和，而且掩蓋了含量小的有機物的吸收信號，引起光譜測量誤差，試驗中雖然優(yōu)化了建模的譜區(qū)以避開水峰的干擾，但模型預(yù)測結(jié)果仍不理想，在以后的研究中可以嘗試選擇合適光譜測量條件如改變光程來提高靈敏度和減少水分的飽和干擾。另外，樣品的數(shù)量和種類有限，難以覆蓋綠茶所有含量范圍，有待進一步擴大樣品范圍，以提高模型的適用性。當分析樣品和所采用的儀器改變時，須進一步優(yōu)化模型并進行驗證和定期校正。

圖2 綠茶7種成分的近紅外模型的預(yù)測值與化學(xué)真值的相關(guān)性Fig.2 Correlation between predicted values of NIR models and true values of seven components in green tea

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Influence of sample shape on the quantitative prediction of the quality components in green tea by near infrared spectroscopy（NIRS）

XU Rong-rong，REN Guang-xin，WANG Sheng-peng，WANG Yu-xia，ZHANG Zheng-zhu*
（Key Laboratory of Tea Biochemistryamp;Biotechnology，Ministry of Education，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

The quantitative prediction models of seven main components including moisture content，total nitrogen，total crude fiber，water extract，tea polyphenols（TPP），caffeine and free amino acids（AA）in 110 green tea samples were established through partial least squares（PLS）by NIRS respectively.The effect of NIR spectra of integrated and crushed samples on the models of seven components as well as the green tea soup on the models of water extract，tea polyphenols（TPP），caffeine and free amino acids（AA）were investigated. The optimal models of seven components were developed by crushed samples.The root mean square errors of cross-validation（RMSECV）and the root mean square errors of prediction（RMSEP）were less than 0.5.The determination coefficients（R2）of validation exceeded 0.9，except for crude fiber model with R2of 0.8598.The effect of models established by tea soup was not ideal，among which the ratios of prediction to deviation（RPD）of caffeine and AA were less than 2.5%with R2not exceeding 0.5.The results showed that the models built by crushed green tea samples were more reliable than by integrated samples or tea soup，NIRS technology could be employed for quantitative determination of seven kinds of components in green tea rapidly.

green tea；near infrared spectroscopy（NIRS）；sample shape；quantitative model；rapid determination

TS272.5+1

A

1002-0306（2012）14-0072-05

2011－11－29 *通訊聯(lián)系人

徐榮榮（1987-），女，碩士研究生，主要從事茶葉生物化學(xué)方面的研究。

農(nóng)業(yè)部948項目（2011-Z64）；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2010GB2C300204）。