邵 靜，高志紅，*，章 鎮(zhèn)，王麗平，王培培，羅曉燕

（1.南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇南京210095；2.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京210095）

果梅果實浸提液抑菌活性的研究

邵 靜1，高志紅1，*，章 鎮(zhèn)1，王麗平2，王培培1，羅曉燕1

（1.南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇南京210095；2.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京210095）

比較“小葉豬肝”和“軟條紅梅”兩個梅品種果實不同浸提液的抑菌活性，結果表明：梅果實浸提液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和豬鏈球菌三種待測細菌均有抑制作用，其中對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用強于豬鏈球菌；以不同的浸提劑浸提，采用正己烷作浸提劑時的浸提成分抑菌活性最強，丙酮次之；采用不同的浸提方法浸提抑菌活性差異不顯著；兩個品種的梅果實抑菌活性差異不顯著。

梅果實，浸提液，抑菌活性

梅（Prunus mume Sieb.et Zucc.），薔薇科（Rosaceae）植物，目前主要分布在我國的浙江、廣東、江蘇、云南、福建、湖南、臺灣和日本，韓國和朝鮮也有少量栽培[1]。早在《神農本草》中就有記載，梅的花、果、枝、葉等均可入藥；李時珍在《本草綱目》中記載，梅有下氣、安心、止渴、止咳、止痛、止傷寒煩渴、冷熱瀉痢、消腫解毒之功效，可治32種疾病[2]?，F代醫(yī)學的研究表明，梅具有靜血殺菌和抑制癌細胞的作用，如烏梅煎劑可以抑制艾氏腹水[3]，梅可以明目益氣，煎服可治療呼吸急促和氣喘，曬干后可治療便秘，也可制成乳劑再配制成飲料?！熬G萼”梅的花苞入藥，有消炎解毒的功效[1]。近年來的研究發(fā)現，烏梅具有廣譜殺菌、抑菌作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等細菌有較強的抑制作用[4]，后來的研究發(fā)現青梅原果對以上三種細菌也有較強的抑菌作用[5]，日本的研究發(fā)現果梅高溫提取物對流感病毒有較強的抑制作用[6]，Xia等[7]的研究發(fā)現梅種子甲醇提取物對多種細菌有抑制作用，但關于不同果梅品種的果實抑菌效果的差異以及采用不同浸提劑浸提等方面的研究未見報道。本研究主要對“軟條紅梅”和“小葉豬肝”兩個梅品種的抑菌活性進行探究，研究不同浸提方法和不同浸提劑浸提對兩個梅品種果實抑菌活性的影響，為今后更好地開發(fā)利用果梅、分析果梅果實的功能成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品 于青梅采收期，在南京農業(yè)大學國家梅種植資源圃采集兩個果梅品種“小葉豬肝”和“軟條紅梅”的果實，貯存于-20℃冰箱內備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 梅果實浸提液的制備 將果梅果實去皮、去核、破碎，加入等量的浸提劑，室溫下浸提24h，離心，取上清液；將剩余部分置于水浴鍋內加熱至90℃并保持10min，進一步離心取上清，實驗所得浸提液濃度均為1g/mL（1mL浸提液中含有1g果肉），保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 菌株及其菌懸液制備 本實驗菌株為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及豬鏈球菌。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌菌株接種到LB固體培養(yǎng)基上，豬鏈球菌接種到THB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)從培養(yǎng)基上挑取單一菌落至MH培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至菌液濃度達到所需濃度。

菌懸液的制備：無菌操作下將上述培養(yǎng)的細菌調至0.5麥氏比濁單位，用于實驗。

1.2.3 濾紙片擴散法測定梅果實浸提液的抑菌圈[8-9]

1.2.3.1 梅果實浸提液藥敏紙片的制備 取定量濾紙，用打孔機制備成直徑為6mm的圓形紙片，高壓滅菌后烘干備用。取10片濾紙片置于無菌管內，加入100μL待測果梅浸提液浸泡，待其全部吸收后用于紙片擴散實驗。以浸提劑浸泡的濾紙片做空白對照。

1.2.3.2 接種培養(yǎng) 在無菌操作下，取200μL菌懸浮液置于無菌平皿中，用無菌三角玻璃棒涂布均勻，用無菌鑷子將浸在果梅浸提液中的無菌濾紙片貼于涂布細菌的平皿中，一個平皿可以貼7個濾紙片，即在平皿中間貼一片對照，在周圍等距離貼六片果梅浸提液的濾紙片，每個樣品重復三次。放于37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h，采用十字交叉法測定抑菌圈大小。

1.2.4 梅果實浸提液最小抑菌濃度的測定 采用CLSI推薦的微量兩倍稀釋法進行。將96孔平板置于超凈工作臺上，開紫外照射2～3h，將待測菌液稀釋至0.5麥氏比濁單位，分別在第一排孔加入180μL，其余孔加入100μL，取20μL果梅浸提液加入第一孔，混勻后吸100μL加入第二孔，混勻，吸100μL加入第三孔，混勻，照此規(guī)律依次加樣到第11孔，取100μL，棄去，第12孔不加待測浸提液，作為對照，以浸提劑作陰性對照，重復2～4次，將平板置于37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h，觀察結果。

1.3 數據處理

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同浸提劑提取對抑菌活性的影響

實驗采用“軟條紅梅”果實為實驗材料，測定不同浸提劑浸提對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和豬鏈球菌抑菌活性的影響。由表1結果可知，采用不同溶劑浸提，軟條紅梅對3種實驗菌種的抑菌活性存在一定的差異。通過Duncan方法比較發(fā)現，不同的浸提液對大腸桿菌的抑菌活性不同，其中無菌水提取液與甲醇、乙醇、丙酮和正己烷提取液存在顯著性差異。不同提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌活性也存在顯著性差異。其中丙酮提取液與正己烷提取液無顯著性差異，與無菌水、甲醇和乙醇提取液存在顯著性差異。不同浸提液對豬鏈球菌的抑菌活性存在一定的差異，其中無菌水、甲醇、乙醇和丙酮浸提液抑菌活性無顯著性差異，正己烷浸提液與其他四種提取液抑菌活性存在顯著性差異（表1）。綜上所述，采用正己烷作為浸提劑抑菌效果最好。

“軟條紅梅”不同浸提液對3種實驗菌種的最小抑菌濃度存在一定的差異，其中對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度較小，而對豬鏈球菌的最小抑菌濃度較大。通過Duncan方法對MIC結果比較發(fā)現：梅果實的不同浸提液對三種細菌的最小抑菌濃度存在差異，其中采用甲醇、乙醇、丙酮和正己烷浸提對大腸桿菌的抑菌活性無顯著性差異，但與無菌水浸提液存在顯著性差異，梅果實的不同浸提液對枯草芽孢桿菌和豬鏈球菌的抑菌活性存在差異，最小抑菌濃度最小的是正己烷浸提液。另在K-B紙片擴散實驗中發(fā)現甲醇、乙醇、丙酮等溶液對三種細菌有抑制作用，但在培養(yǎng)基連續(xù)稀釋實驗中發(fā)現這三種溶劑對三種測試菌種沒有抑制作用，這可能是因為這三種溶劑高濃度對細菌有抑制作用，低濃度沒有抑制作用（表1）。綜上所述，正己烷浸提液的最小抑菌濃度最小，抑菌效果最好，這與K-B紙片擴散所得結論一致。

表1 軟條紅梅不同浸提液抑菌圈直徑及最小抑菌濃度Table 1 Inhibitory zone diameters and MIC of‘Ruantiaohongmei’using different extraction solvents

2.2 不同品種及不同浸提方法浸提抑菌活性的比較

實驗比較了“軟條紅梅”和“小葉豬肝”兩個品種梅果實在常溫浸提和高溫浸提的抑菌活性，實驗結果如表2所示。采用“軟條紅梅”和“小葉豬肝”兩個品種對3種實驗菌種的抑菌活性存在一定的差異，“軟條紅梅”對3種細菌的抑菌活性高于“小葉豬肝”，但方差分析的結果表明，兩個品種果實浸提液對大腸桿菌的抑菌活性存在顯著性差異，而對枯草芽孢桿菌和豬鏈球菌的抑菌活性無顯著性差異（表2）。

采用常溫浸提和高溫浸提兩種浸提方法所得的梅果實浸提液對3種實驗菌種的抑菌活性存在一定的差異，但方差分析的結果表明這兩者之間無顯著性差異，這說明浸提方法對梅果實浸提液的抑菌效果無影響（表2）。

表2 兩個品種浸提液的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度Table 2 Inhibitory zone diameters and MIC of two kinds of extractions

由表2可知，“軟條紅梅”和“小葉豬肝”兩個品種梅果實在常溫和高溫兩種浸提條件下的最小抑菌濃度存在一定的差異，通過Duncan方法比較發(fā)現，相同浸提條件下兩者對大腸桿菌的抑菌活性無顯著性差異，同一品種梅果實不同浸提方法浸提所得浸提液其抑菌活性存在顯著性差異；高溫浸提時，兩個品種梅果實對枯草芽孢桿菌的抑菌活性存在顯著性差異，常溫浸提時兩者抑菌活性無顯著性差異，而對豬鏈球菌的抑菌活性剛好相反。

3 討論

關于梅抑菌方面的研究大部分集中于梅的根、莖、葉、花和種子及其加工品烏梅，對于梅果實的相關研究較少，本實驗主要針對“小葉豬肝”和“軟條紅梅”兩個品種梅果實的不同浸提液的抑菌活性進行了研究，研究結果表明梅果實浸提液對三種細菌均有抑制作用，但并不能說明其具有廣譜殺菌作用。另外，前人關于梅果實的抑菌作用的研究大多集中于青梅，對于紅梅的研究鮮有報道。

梅果實浸提液對供試的三種細菌均有抑制作用，但對不同的細菌其抑制作用不同，其中對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用較強，這與陳虹等[5]的研究一致，對豬鏈球菌的抑制作用較小，這方面的研究未見報道。

采用不同的浸提劑浸提，其抑菌活性不同，研究發(fā)現以正己烷作為浸提劑浸提抑菌活性較高，丙酮次之，在本研究中采用K-B紙片擴散法和培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法測定梅果實浸提液的抑菌活性，以浸提劑為陰性對照。但研究發(fā)現在K-B紙片擴散實驗中，丙酮、乙醇和甲醇對細菌有抑菌作用，但采用培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法測定最小抑菌濃度的實驗中發(fā)現，這三種溶液對三種細菌無抑制作用，可能是因為這三種溶劑在高濃度下對細菌有抑制作用，濃度過低則無抑制作用，也可能是在培養(yǎng)基連續(xù)稀釋培養(yǎng)過程中溶劑揮發(fā)，因此無抑制作用。

本實驗中采用常溫浸提和90℃高溫浸提，通過分析發(fā)現兩種浸提方法產生的梅果實浸提液抑菌活性在P=0.05時差異不顯著，但最小抑菌濃度差異顯著，且高溫浸提最小抑菌濃度較常溫浸提低，其中含量最低的是0.013mg/mL。

在本實驗中比較了生產上常用的“小葉豬肝”和“軟條紅梅”兩個品種梅果實的丙酮浸提液的抑菌活性，不同品種的梅果實的抑菌活性可能存在一定的差異，但只在某些條件下差異顯著，袁曉紅等[10]對不同品種楊梅的抑菌活性進行比較發(fā)現，不同品種的楊梅對甲型副傷寒沙門氏菌的抑菌活性有一定的差異，但沒有顯著性的差異，目前在果梅上未見相關報道，因此還需深入研究。

在本實驗中采用了微量兩倍稀釋法測定最小抑菌濃度，這與之前陳虹等[5]、李躍等[11]所采用的方法不同，這種方法具有簡便、快捷、便于操作等優(yōu)點。

4 結論

實驗結果表明，梅果實浸提液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和豬鏈球菌有抑制作用，綜合比較發(fā)現以正己烷作浸提劑浸提抑菌活性最好，丙酮次之，在今后的研究中可以選用這兩種溶劑浸提。采用不同的浸提方法對三種待測菌的抑菌活性相差不大，在今后的研究中可以不予考慮。本研究中比較了“小葉豬肝”和“軟條紅梅”兩個品種梅果實的抑菌活性，但對于其他品種抑菌活性是否一致還需進一步的研究。

[1]褚孟嫄.中國果樹志[M].北京：中國林業(yè)出版社，1999.

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Study on antibacterial activity of the extracts from Japanese apricot fruit

SHAO Jing1，GAO Zhi-hong1，*，ZHANG Zhen1，WANG Li-ping2，WANG Pei-pei1，LUO Xiao-yan1
（1.College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

The antibacterialactivity ofdifferentextracts from the fruits ofJapanese apricotcultivars 'Xiaoyezhugan'and'Ruantiaohongmei'were investigated.The results showed that the extracts of Japanese apricot fruit significantly inhibited the activities of E.coli，Bacillus subtilis and Streptococus suis.Especially，it had more efficient antibacterial activity on E.coli and Bacillus subtlis.The inhibition activity of the extract extracted with n-hexane showed the best，acetone was better.The inhibition activity of the extract extracted with different extraction methods and from the two cultivars was not significant.

Japanese apricot fruit；extract；antibacterial activity

TS255.1

A

1002-0306（2012）05-0105-03

2011－06－03 *通訊聯(lián)系人

邵靜（1987-），女，在讀碩士，研究方向：果樹生理及分子生物學。

農業(yè)部公益性行業(yè)專項（201003058）。