曹艷妮，劉通訊

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

普洱生茶和熟茶香氣中萜烯類和甲氧基苯類成分分析

曹艷妮，劉通訊

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

采用同時(shí)蒸餾萃取法（SDE）提取，經(jīng)GC-MS聯(lián)用測(cè)定不同儲(chǔ)存時(shí)間普洱生茶和熟茶的香氣成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：萜烯類和甲氧基苯類化合物是普洱茶香氣的主要成分。其中的萜烯類化合物主要以單萜類及其含氧衍生物為主，還含有部分倍半萜類及其含氧衍生物、類胡蘿卜素及紫羅蘭酮的氧化降解產(chǎn)物；甲氧基苯類化合物以1，2，3-三甲氧基苯、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯為主。

普洱茶，萜烯類，甲氧基苯類，儲(chǔ)存時(shí)間，香氣成分

萜類化合物（terpenoids）是一類由甲戊二羥酸（mevalonic acid，MVA）衍生而成，基本碳架多具有2個(gè)或2個(gè)以上異戊二烯單位結(jié)構(gòu)特征的化合物[1]，廣泛分布于植物細(xì)胞中。單萜是最常見(jiàn)的萜烯類化合物，茶葉中常見(jiàn)的單萜大都帶有濃郁的甜香、花香和木香，如芳樟醇具有百合花香或玉蘭香，α-松油醇具有丁香，香葉醇具有溫和調(diào)諧的薔薇香，橙花醇具有輕柔的甜潤(rùn)香。它們含量的高低以及協(xié)調(diào)作用在一定程度上左右著茶葉的香氣特征。除了萜烯類物質(zhì)以外，甲氧基苯類作為普洱茶中另一主要組分備受關(guān)注，尤其在經(jīng)過(guò)后發(fā)酵的普洱熟茶中含量豐富。許多研究認(rèn)為，這些物質(zhì)賦予普洱茶典型霉味和陳香[2]，是普洱茶沉香甘醇的主要原因。本文采用SDE-GC-MS聯(lián)用分析法測(cè)定了不同儲(chǔ)存時(shí)間的五種普洱生茶和五種普洱熟茶的香氣成分，著重比較了普洱生茶和熟茶中萜烯類和甲氧基苯類的化學(xué)組成、含量差異，以及各種成分隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化而產(chǎn)生的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱熟茶和生茶 中國(guó)云南西雙版納勐海國(guó)營(yíng)黎明茶廠2009、2007、2005、2003、2001年出品，共10個(gè)樣品；二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉 均為分析純。

Trace DSQⅡGC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo fisher公司；HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（30m× 0.25mm，0.25μm） 美國(guó)安捷倫科技公司；KQ5200DE型超聲波清洗器 頻率為25kHz；氮吹儀，同時(shí)蒸餾萃取器，電熱套。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 同時(shí)蒸餾-萃取法（SDE）提取香氣成分 準(zhǔn)確稱取普洱茶樣品50g置于1000mL圓底燒瓶中，加入200mL去離子水浸泡，接至同時(shí)蒸餾-萃取裝置的一端，控制溫度保持微沸狀態(tài)。另取二氯甲烷30mL置于250mL單頸圓底燒瓶中，接在同時(shí)蒸餾-萃取裝置的另一端，用電熱套加熱，兩邊達(dá)到平衡回流穩(wěn)定后，保持萃取2h，二氯甲烷萃取液用無(wú)水硫酸鈉脫水干燥，然后用氮吹儀揮發(fā)溶劑，濃縮得1mL具有濃郁香味的淡黃色透明液體，過(guò)0.45μm膜，用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 GC-MS色譜條件 氣相色譜條件：GC條件：采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為220℃；載氣為高純氦氣，純度gt;99.999%，流速1mL/min；柱溫起始為50℃，以5℃/min速度升至150℃，保持2min，以5℃/min速度升至180℃，保持2min，再以5℃/min速度升至230℃，保持7.5min，最后以3℃/min速度升至280℃，保持5min；分流比：10∶1進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：轟擊電子能量：70eV，電子源電離方式：EI，離子源溫度：200℃，進(jìn)樣量：1μL，掃描范圍：29～550amu，掃描方式：全掃描。

1.2.3 定性和定量方法 按上述分析條件對(duì)香氣成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，將各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖利用Wiley及NIST兩個(gè)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)，對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行串聯(lián)檢索，并與文獻(xiàn)值對(duì)照相結(jié)合進(jìn)行人工解析，再結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)，并參考有關(guān)茶葉芳香物質(zhì)成分的分析結(jié)果（tR值）進(jìn)行組分比較鑒定，并對(duì)部分成分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照，同時(shí)對(duì)總離子流量（TIC）用峰面積歸一化定量，得到各組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶香氣成分中萜烯類化合物組成分析

圖1 五種生茶和五種熟茶中主要單萜類物質(zhì)平均含量的比較Fig.1 Comparison of the main lerpenes components in five raw tea samples and five ripe tea samples

2.1.1 生茶和熟茶中主要萜烯類化合物比較分析 生茶萜烯類15種，其中單萜類7種、單萜類含氧衍生物5種，類胡蘿卜素和紫羅酮降解產(chǎn)物2種、倍半萜含氧衍生物1種。熟茶萜烯類24種，其中單萜類6種、倍半萜醇1種、單萜類含氧衍生物10種、類胡蘿卜素和紫羅酮降解產(chǎn)物4種、倍半萜含氧化合物3種。普洱茶香氣成分中的萜類化合物主要以單萜類及其含氧衍生物為主，還含有部分倍半萜類及其含氧衍生物、類胡蘿卜素及紫羅蘭酮的氧化降解產(chǎn)物。其形成與長(zhǎng)時(shí)間的堆積發(fā)酵及日光干燥中產(chǎn)生的氧化降解和光氧化作用有關(guān)。

生茶萜類化合物含量最高的前五種分別為芳樟醇吡喃氧化物（13.58%）、α-松油醇（10.13%）、1，2-環(huán)氧芳樟醇Ⅱ（7.10%）、芳樟醇（4.18%）、1，2-環(huán)氧芳樟醇Ⅰ（4.14%）；熟茶萜類化合物含量最高的前五種分別為芳樟醇吡喃氧化物（14.07%）、1，2-環(huán)氧芳樟醇Ⅱ（5.87%）、1，2-環(huán)氧芳樟醇Ⅰ（4.03%）α-松油醇（2.81%）、薄荷烯酮（1.32%）。

在普洱生茶所鑒定出來(lái)的7種單萜類化合物除香草醇外，其余6種在熟茶中都有檢出。但是生茶與熟茶之間相對(duì)含量的平均值差異極其顯著（圖1）。除了薄荷醇的含量增加了48.71%以外，其余五種單萜類的含量都顯著降低，分別降低了90.59%、69.28%、72.25%、77.87%、85.66%，即經(jīng)歷后發(fā)酵階段后，茶葉中單萜類物質(zhì)的損耗巨大。

2.1.2 不同儲(chǔ)存時(shí)間的生茶和熟茶中主要單萜化合物比較分析 生茶中六種單萜類物質(zhì)含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加含量先減少，然后又呈現(xiàn)增加趨勢(shì)（圖2）。其中2007年、2005年的生茶各單萜類物質(zhì)含量最低。筆者分析可能在采摘、揉捻、干燥的過(guò)程中生成了部分游離態(tài)的單萜化合物，該類物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)活潑極易被氧化分解，故在剛出品后的兩年隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加含量驟降，隨后在生茶溫和的后發(fā)酵過(guò)程中，又隨著單萜類糖苷的降解而得到累積。對(duì)比2009年生茶和2001年生茶，除了4-萜烯醇以外，單萜類物質(zhì)的含量仍然是減少的。芳樟醇、薄荷醇、α-松油醇、橙花醇、香葉醇的含量分別減少了0.93%、40.34%、25.36%、41.02%、60.73%，4-萜烯醇含量增加了70.94%。

圖2 不同儲(chǔ)存年份的生茶主要單萜類物質(zhì)含量Fig.2 Comparison of the main lerpenes components in five raw tea samples with different storage time

熟茶中除了2003年茶樣的薄荷醇，2005年、2007年茶樣的橙花醇未檢出外，六種單萜類物質(zhì)含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加，含量普遍呈現(xiàn)減小趨勢(shì)（圖3）。對(duì)比2009年熟茶和2001年熟茶，芳樟醇、薄荷醇、萜烯醇、α-松油醇、橙花醇、香葉醇的含量分別減少了76.67%、57.34%、13.89%、47.97%、63.37%、50.00%。

圖3 不同儲(chǔ)存年份的熟茶主要單萜類物質(zhì)含量Fig.3 Comparison of the main lerpenes components in five ripe tea samples with different storage time

2.2 普洱茶香氣成分中甲氧基苯類化合物組成分析

2.2.1 生茶和熟茶中主要甲氧基苯類化合物比較分析 生茶中鑒定出甲氧基苯化合物11種，熟茶12種，其中共有成分8種，分別是1，2-二甲氧基苯、3，4-二甲氧基甲苯、1，2，3-三甲氧基苯、4-乙基-1，2-二甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯、乙酰丁香酮、5-烯丙基-1，2，3-三甲氧基苯。對(duì)比其在生茶和熟茶中的含量發(fā)現(xiàn)（圖4），除3，4-二甲氧基甲苯、5-烯丙基-1，2，3-三甲氧基苯的含量分別降低了44.52%和13.23%以外，其它六種甲氧基苯類化合物的含量都顯著增加，分別增加了98.5%、218.7%、140.4%、953.8%、89.6%、176.3%。

圖4 五種生茶和五種熟茶中主要甲氧苯類物質(zhì)平均含量的比較Fig.4 Comparison of the main methoxybenzene components in five raw tea samples and five ripe tea samples

生茶中甲氧基苯類化合物含量最高的3種分別是1，2，3-三甲氧基苯（8.40%）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（3.83%）和3，4-二甲氧基甲苯（1.65%）。熟茶中甲氧基苯類化合物含量最高的3種分別是1，2，3-三甲氧基苯（26.76%）、1，2，4-三甲氧基苯（7.99%）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（7.26%）。1，2，3-三甲氧基苯是生茶和熟茶中的甲氧基苯類含量最高的物質(zhì)，這與洪濤[2]、呂海鵬[3]等的研究結(jié)果一致。

另外，生茶獨(dú)有的3種甲氧基苯類化合物分別為1，3-二甲氧基苯酚、2，5-二甲氧基-苯甲醇、3，4，5-三甲氧基甲苯，且只在2005年和2003年的樣品中檢出。熟茶獨(dú)有的5種甲氧基苯類化合物分別為4-丙基-1，2-二甲氧基苯、1，2，3，4-四甲氧基苯、1，2-二甲氧基-4-丙烯基苯、2，4，6-三甲氧基苯乙酮、3-甲氧基-2，5，6-三甲基苯酚。除了后兩種在個(gè)別年份的茶樣未檢出，其余成分都有檢出。在生茶和熟茶獨(dú)有的甲氧基苯類化合物中，生茶的3，4，5-三甲氧基甲苯含量最高，熟茶的1，2，3，4-四甲氧基苯含量最高，平均含量分別為1.13%和1.57%。

2.2.2 不同儲(chǔ)存時(shí)間的生茶和熟茶中主要甲氧基化合物比較分析 生茶中的甲氧基苯類化合物隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，基本上呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)（圖5），最具代表性的是1，2，3-三甲氧基苯和1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯。這兩種甲氧基苯化合物的含量在2005年生茶樣品中達(dá)到最高，2003年有所降低，2001年出現(xiàn)更大幅度的降低。具體原因有待進(jìn)一步分析。

以熟茶中主要的7種甲氧基苯類化合物為例，其含量均出現(xiàn)較大波動(dòng)，且變化趨勢(shì)不一致（圖6）。對(duì)比2009年熟茶和2001年熟茶，除了1，2–二甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯含量降低以外（分別降低了34.85%、12.88%），3，4-二甲氧基甲苯、1，2，3-三甲氧基苯、1，2，3-三甲氧基-5-甲苯、乙酰丁香酮、1，2，3，4-四甲氧基苯的含量均增加，分別增加了25.37%、17.46%、375.27%、628.23%、6.29%。其中1，2，3-三甲氧基-5-甲苯和乙酰丁香酮的增幅最大。

圖5 不同儲(chǔ)存年份的生茶主要甲氧基苯類物質(zhì)含量Fig.5 Comparison of the main methoxybenzene components in five raw tea samples with different storage time

圖6 不同儲(chǔ)存年份的熟茶主要甲氧基苯類物質(zhì)含量Fig.6 Comparison of the main methoxybenzene components in five ripe tea samples with different storage time

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，萜烯醇類和芳香醇類化合物主要以鍵合態(tài)糖甙形式作為香氣前驅(qū)體存在于茶鮮葉中[5]，從茶葉中已分離鑒定了多種單萜烯醇的櫻草糖甙和葡萄糖甙，包括順-3-己烯醇、香葉醇、芳樟醉、2-苯乙醇、苯甲醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、Ⅱ及水楊酸甲酯等香氣組分[6-7]，這些游離態(tài)的萜烯類化合物直接或間接地經(jīng)過(guò)立體專一性的二聚作用、環(huán)化和重排，由無(wú)環(huán)的前身所衍生[8]。川上美智子[9]研究認(rèn)為，甲氧基苯類化合物的生成是由于普洱茶中的EGCG在氧化降解過(guò)程中脫沒(méi)食子酰基形成沒(méi)食子酸，而沒(méi)食子酸的羥基（OH-）的氫被（-CH3）取代實(shí)現(xiàn)甲基化，則產(chǎn)生甲氧基苯的類似結(jié)構(gòu)化合物。化工上，1，2，3-三甲氧基苯的制備方法通常是將焦性沒(méi)食子酸（鄰苯三酚）與烷氧基化試劑（如硫酸二甲酯）在堿性條件下反應(yīng)[10]。1，2-二甲氧基苯也有愈創(chuàng)木酚（鄰羥基苯甲醚）法和鄰苯二酚法兩種合成路線[11]。以上可作為甲氧基苯類的生物合成機(jī)理的參考。張春花[12]等的研究表明，普洱茶經(jīng)四種微生物（黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母、綠色木霉）發(fā)酵均生成大量的甲氧基苯類化合物，其中黑曲霉固態(tài)發(fā)酵的普洱茶甲氧基苯及其衍生物含量最高。本研究在生茶中鑒定出7.35%～30.39%的甲氧基苯類化合物，說(shuō)明甲氧基苯類化合物的生成并不局限于渥堆后發(fā)酵階段。甲氧基苯類的形成機(jī)理、在普洱茶加工各階段的生成情況、微生物發(fā)酵的酶系和生化作用機(jī)理等還有待于進(jìn)一步研究。

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Analysis of lerpenes and methoxybenzene components in aroma composition of pu-erh raw tea and ripe tea

CAO Yan-ni，LIU Tong-xun
（College of Light and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Ten kinds of pu-erh tea samples which had different storage time were investigated，the simultaneous distillation and extraction method（SDE）and gas chromatography-masss pectrometry（GC-MS）were used to determine the volatiles in pu-erh tea.Results indicated that the terpenes and methoxybenzene compounds were the main aroma components in puer teas.Monoterpenoids and its oxygenated derivatives were the main terpenes compounds，it also comclude sesquiterpenes and its oxygenated derivatives，oxidation degradation products of carotenoids and ionon.1，2，3-trimethoxybenzene，5-methyl-1，2，3-trimethoxybenzene were the main methoxybenzene components.

pu-erh tea；lerpenes；methoxybenzene；storage time；aroma components

TS272.4

A

1002-0306（2012）05-0128-04

2011－04－15

曹艷妮（1986-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。