王慧玲，閆愛(ài)玲，孫磊，張國(guó)軍，王曉玥，任建成，徐海英?

1北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院，北京 100093；2北京市落葉果樹(shù)工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097

0 引言

【研究意義】葡萄具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且味美多汁，是世界五大名果之一。然而葡萄生產(chǎn)具有地域性和季節(jié)性的特點(diǎn)，要實(shí)現(xiàn)各地周年供應(yīng)新鮮葡萄，發(fā)展貯藏保鮮事業(yè)很有必要。低溫冷藏是現(xiàn)代葡萄貯藏保鮮的主要方式[1]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)葡萄品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。香氣是構(gòu)成葡萄品質(zhì)的主要因素之一，特別是玫瑰香味深受消費(fèi)者喜歡[2]。研究采后低溫貯藏期間玫瑰香氣成分的變化規(guī)律，將為建立更科學(xué)的葡萄貯藏體系，保證葡萄優(yōu)良風(fēng)味品質(zhì)提供理論和實(shí)踐依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】單萜是葡萄果實(shí)中含量最豐富的萜類(lèi)化合物，被認(rèn)為是玫瑰香味的主要呈香物質(zhì)[3]。根據(jù)游離態(tài)單萜類(lèi)化合物的含量高低，歐洲種釀酒葡萄品種被分為玫瑰香型（游離態(tài)單萜化合物總量高達(dá)6 mg·L-1）、非玫瑰香芳香型（游離態(tài)單萜化合物總量達(dá)1—4 mg·L-1）和非芳香型（游離態(tài)單萜化合物總量低于1 mg·L-1）3類(lèi)[4]。在葡萄果實(shí)中單萜化合物以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)存在，一般認(rèn)為游離態(tài)是揮發(fā)性化合物，可以被直接感知，與葡萄漿果的香氣有關(guān)。而糖苷結(jié)合態(tài)單萜不易揮發(fā)，對(duì)葡萄的香氣沒(méi)有直接貢獻(xiàn)，但是它們可以通過(guò)增加水解作用而轉(zhuǎn)化為游離態(tài)化合物，從而改變葡萄的芳香特性[5]。影響單萜化合物積累的因素很多，除了遺傳基因組成，還受生長(zhǎng)環(huán)境及栽培技術(shù)措施等外在因素的影響[6-8]。然而目前對(duì)葡萄單萜成分的研究主要集中在采前階段，在低溫貯藏過(guò)程中，果實(shí)的理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生或多或少的變化[9]。科學(xué)家對(duì)葡萄在低溫貯藏過(guò)程中的理化特性和貯藏特性進(jìn)行了研究[10]，并且也做了很多努力來(lái)揭示葡萄貯藏過(guò)程中維生素和多酚等營(yíng)養(yǎng)成分的變化[11]。但是關(guān)于葡萄在低溫貯藏期間的香氣組成和含量變化研究還比較少，特別是針對(duì)大眾喜愛(ài)的玫瑰香味的研究更少。成明[12]以‘玫瑰香’葡萄為試材的研究表明，冷庫(kù)貯藏期間，葡萄的香氣成分（醛類(lèi)和醇類(lèi)）隨著貯藏期的延長(zhǎng)，相對(duì)含量均呈下降趨勢(shì)；主要物質(zhì)（E）-2-己烯醛、里那醇、橙花醇的相對(duì)含量也均呈下降趨勢(shì)。張鵬等[13]以‘無(wú)核寒香蜜’葡萄為試材，研究發(fā)現(xiàn)其主要揮發(fā)性成分乙酸乙酯、青葉醛、正己醇、葉醇等化合物在冷藏45 d后相對(duì)含量均低于冷藏15 d的果實(shí)。盡管MATSUMOTO和 IKOMA[14]研究了不同采后貯藏對(duì)‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄果實(shí)中玫瑰香味和香氣揮發(fā)物含量的影響，但也只研究了單一萜類(lèi)化合物里那醇含量的變化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】綜上可見(jiàn)，葡萄果實(shí)在低溫貯藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生風(fēng)味變化，但是仍然缺乏詳細(xì)全面的特定代謝物類(lèi)型和水平的信息。已有的研究也主要集中于游離態(tài)化合物檢測(cè)，缺乏糖苷結(jié)合態(tài)香氣化合物的代謝譜數(shù)據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以?xún)蓚€(gè)優(yōu)新玫瑰香型葡萄品種‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’為試材，探討低溫貯藏過(guò)程中游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)單萜組分和含量變化趨勢(shì)，從更加全面的代謝物角度詮釋玫瑰香氣成分變化規(guī)律，為更好地研究貯藏期間葡萄風(fēng)味品質(zhì)的變化和最佳貯藏條件的建立提供理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年8—9月在北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院進(jìn)行。

1.1 材料

供試鮮食葡萄品種為‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’，兩者均是北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院育成的紅色早中熟優(yōu)新品種，選自‘京秀’和‘香妃’的雜交后代。果肉質(zhì)地較脆，口味甜香，‘瑞都紅玫’具有明顯的玫瑰香味，‘瑞都早紅’淡淡的玫瑰香味，成熟時(shí)可溶性固形物含量均可以達(dá)到16%以上[15-16]。試驗(yàn)植株為露地栽培 7年生自根苗，定植于北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)院葡萄試驗(yàn)園內(nèi)，單臂籬架水平龍干整形，株行距0.75 m×2 m，試驗(yàn)地土壤肥力中等，pH 6.9。采用簡(jiǎn)易避雨、地表園藝地布覆蓋、滴灌供水和常規(guī)病蟲(chóng)害等管理模式，生長(zhǎng)期內(nèi)修剪及肥水管理一致。依據(jù)往年物候期記載結(jié)合可溶性固形物含量確定兩個(gè)品種的成熟期進(jìn)行樣品采集，貯藏試驗(yàn)地點(diǎn)在北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院冷庫(kù)（（2±1）℃，90% RH）。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇顆粒飽滿(mǎn)、果粒大小均勻、無(wú)病、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)落粒的葡萄果穗放入開(kāi)孔紙板箱，每箱5 kg。預(yù)冷至-1—0℃，放入PE葡萄保鮮膜中，封口入庫(kù)。每個(gè)品種設(shè)3—5次重復(fù)，每隔15 d進(jìn)行調(diào)查并取樣測(cè)試相關(guān)指標(biāo)。

1.3 外觀品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

失重率：穗重失重率（%）=（貯前穗重-貯后穗重）/貯前穗重×100。爛果率：爛果率（%）=（腐爛果粒的個(gè)數(shù)/果?？倲?shù)）×100。落粒率：落粒率（%）=落粒果重/總果重×100。果柄耐拉力：將葡萄果柄與彈簧秤相連，沿果?？v軸方向拉至果柄從果實(shí)上脫離，記錄彈簧秤最終讀數(shù)，即為果柄耐拉力，每個(gè)處理重復(fù)10—20次以上，取平均值。果梗褐變指數(shù)：褐變指數(shù)（%）=∑（各級(jí)穗數(shù)×級(jí)數(shù)）/（最高級(jí)數(shù)×總穗數(shù)）×100；穗軸（果梗）褐變級(jí)別：無(wú)褐變的為0級(jí)，褐變0—1/4為1級(jí)，褐變1/4—1/2為2級(jí)，褐變1/2—3/4為3級(jí)，褐變3/4以上為4級(jí)。

1.4 單萜化合物提取

單萜的提取和測(cè)定參考WEN等[17]的方法，略有改動(dòng)。首先葡萄果實(shí)樣品去除種子，以避免對(duì)揮發(fā)性化合物的提取產(chǎn)生任何可能的影響。其余果實(shí)部分（約50 g）在液氮中研磨，研磨過(guò)程中加入1 g PVPP和0.5 g D-葡萄糖酸內(nèi)酯。得到的果粉樣品在4℃低溫靜置4 h后，立即在4℃下以8 000×g離心10 min，得到澄清的葡萄汁。澄清葡萄汁直接檢測(cè)游離單萜化合物。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立提取。

糖苷結(jié)合態(tài)化合物提取，固相萃取柱（Cleanert PEP-SPE柱，天津博納艾杰爾公司）依次經(jīng)10 mL甲醇和10 mL水活化后，加入2 mL上述澄清葡萄汁樣品。經(jīng)2 mL水洗脫去除一些糖、酸等低分子量的極性化合物后，加入5 mL二氯甲烷洗脫，進(jìn)一步去除大部分游離態(tài)香氣物質(zhì)的干擾，最后用20 mL甲醇將結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)洗脫，收集至50 mL的圓底燒瓶?jī)?nèi)，整個(gè)固相萃取過(guò)程洗脫劑流速保持2 mL·min-1。所得甲醇洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器下蒸發(fā)至干燥，然后重新溶解在10 mL的2 mol·L-1檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.0）中。在40℃的培養(yǎng)箱中，用200 μL 糖苷酶AR 2000（100 mg·L-1，在 pH 5.0 的 2 mol·L-1檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液中）酶解結(jié)合型揮發(fā)性化合物16 h。每個(gè)果汁樣品做2個(gè)獨(dú)立的重復(fù)。

此后，在以下SPME條件下提取游離和結(jié)合態(tài)揮發(fā)物：將5 mL提取液與10 μL 4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標(biāo)）和1 g NaCl混合在20 mL聚四氟乙烯硅隔膜蓋小瓶中。將樣品瓶在 40℃下的 500 r/min攪拌下平衡 30 min。之后將活化的SPME針頭（Supelco，Bellefonte，PA，USA）插入小瓶頂空，在40℃下吸附揮發(fā)性組分30 min。最后，將SPME針頭插入GC進(jìn)樣口8 min，釋放揮發(fā)物。

1.5 單萜化合物檢測(cè)

氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）型號(hào)：Agilent 7890B GC和Agilent 5977A MS（Agilent，美國(guó)）。毛細(xì)管柱為HP-INNOwax（60 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W Scientific，美國(guó)）。

GC-MS條件參考WU等[18]發(fā)表的方法：載氣為高純氦氣（He，＞99.999%），流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為250℃，采樣不分流模式，解析時(shí)間8 min；升溫程序?yàn)?0℃保持1 min，然后以3℃·min-1升溫到220℃，保持5 min。質(zhì)譜電離方式為EI，離子源溫度為230℃，電離能為70 eV，四級(jí)桿溫度為150℃，質(zhì)譜接口溫度為280℃，質(zhì)量掃描范圍為30—350 u。

1.6 單萜化合物定性定量分析

數(shù)據(jù)處理和分析通過(guò) ChemStation軟件（安捷倫科技公司）進(jìn)行，參考WU等[18]的方法?；衔锸紫雀鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留指數(shù)和質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品不可用時(shí)，利用NIST 05標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)，參考標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)和質(zhì)譜匹配來(lái)鑒別。化合物定量使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每種標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇，然后混合在一起。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋?zhuān)垣@得每個(gè)分析物的5—12個(gè)濃度水平。對(duì)沒(méi)有可用標(biāo)準(zhǔn)物的揮發(fā)物，使用具有相似碳原子或結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行量化。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用分析軟件 SPSS 13.0，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，最低顯著水平P＜0.05；主成分分析和聚類(lèi)分析采用MetaboAnalyst 4.0；繪圖采用Excel和Sigma Plot 10.0。

2 結(jié)果

2.1 兩個(gè)葡萄品種低溫貯藏過(guò)程中果實(shí)理化和貯藏特性變化

兩個(gè)品種葡萄果實(shí)可溶性固形物含量在低溫貯藏過(guò)程中均表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢(shì)，‘瑞都紅玫’果實(shí)的可溶性固形物含量高于‘瑞都早紅’（圖1）。兩個(gè)品種果實(shí)中可滴定酸含量在低溫貯藏過(guò)程中變化趨勢(shì)略有差異，‘瑞都紅玫’中可滴定酸含量在貯藏15 d時(shí)有所下降，之后略有上升；而‘瑞都早紅’可滴定酸含量在貯藏30 d內(nèi)上升，之后在貯藏45 d時(shí)略有下降（圖1）?！鸲技t玫’果實(shí)中可滴定酸含量高于‘瑞都早紅’。

失重率、爛果率、落粒率、果柄耐拉力、果梗褐變指數(shù)等是評(píng)價(jià)果品耐貯性好壞、商品性?xún)?yōu)劣的直觀表現(xiàn)。由表1可見(jiàn)，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，兩個(gè)品種的失重率均呈上升趨勢(shì)，‘瑞都早紅’在貯藏后期失重幅度增大，貯藏45 d時(shí)達(dá)到8.57%，‘瑞都紅玫’失重率為 5.46%。在低溫貯藏過(guò)程中，‘瑞都紅玫’的爛果率上升幅度較小。而‘瑞都早紅’在貯藏早期爛果率較低（貯藏15 d時(shí)僅為1.96%），但貯藏中后期爛果現(xiàn)象比較明顯。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，‘瑞都紅玫’落粒率均比較低，‘瑞都早紅’落?，F(xiàn)象明顯，到貯藏45 d達(dá)到50%。兩個(gè)葡萄品種果柄耐拉力都隨貯藏時(shí)間推移而降低，‘瑞都紅玫’的果柄耐拉力高于‘瑞都早紅’。兩個(gè)品種在貯藏早期（15 d）果梗都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)褐變現(xiàn)象，30 d時(shí)都有不同程度的褐變發(fā)生，到貯藏45 d時(shí)，‘瑞都紅玫’果梗褐變程度高于‘瑞都早紅’。綜合5項(xiàng)指標(biāo)，‘瑞都紅玫’的低溫耐貯性?xún)?yōu)于‘瑞都早紅’。

2.2 兩個(gè)品種葡萄果實(shí)中的單萜化合物組分和含量比較

28種游離態(tài)單萜和糖苷結(jié)合態(tài)單萜在兩個(gè)品種葡萄果實(shí)中均檢測(cè)到，含量存在差異（表2、3）。在兩個(gè)品種葡萄果實(shí)中，游離態(tài)單萜含量最高的6個(gè)化合物均是里那醇、β-月桂烯、β-cis-羅勒烯、檸檬烯、cis-呋喃型氧化里那醇和香葉醇。除了個(gè)別化合物如β-香茅醇、cis-氧化玫瑰和trans-呋喃型氧化里那醇，其余游離態(tài)單萜在‘瑞都紅玫’中的含量均高于‘瑞都早紅’（表 2）。游離態(tài)單萜總量在‘瑞都紅玫’中也明顯高于‘瑞都早紅’（圖2）。

表1 兩種鮮食葡萄在低溫貯藏過(guò)程中表觀品質(zhì)指標(biāo)變化Table 1 The changes of fruit appearance quality traits of two grape varieties during storage at (2±1)℃

表2 低溫貯藏過(guò)程中兩種鮮食葡萄果實(shí)中游離態(tài)單萜含量變化Table 2 Changes of free monoterpenes content in two grape varieties during storage at (2±1)℃ (μg·L-1)

續(xù)表2 Continued table 2

兩個(gè)品種葡萄果實(shí)中糖苷結(jié)合態(tài)單萜含量較高的6個(gè)化合物依次是里那醇、β-月桂烯、香葉醇、香葉醛、β-cis-羅勒烯和橙花醚。這些主成分化合物在‘瑞都紅玫’果實(shí)中含量高于‘瑞都早紅’，而氧化玫瑰、香茅醇和橙花醇等糖苷結(jié)合態(tài)單萜的含量在 ‘瑞都早紅’中較高（表3）。但是結(jié)合態(tài)單萜總量仍表現(xiàn)為‘瑞都紅玫’高于‘瑞都早紅’（圖2）。

關(guān)于不同形式單萜含量高低比較，本研究發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)的28種單萜中，除了里那醇、異松油烯、氧化玫瑰、trans-呋喃型氧化里那醇、4-松油烯醇和香葉酸 6種化合物的糖苷結(jié)合態(tài)含量在‘瑞都紅玫’果實(shí)中低于游離態(tài)，其余單萜糖苷結(jié)合態(tài)含量均高于游離態(tài)（表 2、3）。但是總糖苷結(jié)合態(tài)單萜含量略低于游離態(tài)（圖2）；而在‘瑞都早紅’果實(shí)中，除了里那醇，其余27種單萜糖苷結(jié)合態(tài)含量均高于游離態(tài)（表 2、3），總糖苷結(jié)合態(tài)單萜含量高于游離態(tài)（圖2）。

表3 低溫貯藏過(guò)程中兩種鮮食葡萄果實(shí)中糖苷結(jié)合態(tài)單萜含量變化Table 3 Changes of glycosidically-bound monoterpenes content in two grape varieties during storage at (2±1)℃ (μg·L-1)

續(xù)表3 Continued table 3

2.3 低溫貯藏過(guò)程中‘瑞都紅玫’果實(shí)中單萜化合物變化

在整個(gè)低溫貯藏過(guò)程中，‘瑞都紅玫’果實(shí)中主要游離態(tài)單萜成分略有波動(dòng)。貯藏初期（15 d）變化不大，主要游離態(tài)單萜為里那醇、β-月桂烯、β-cis-羅勒烯、cis-呋喃型氧化里那醇、檸檬烯和香葉醇；到貯藏30 d時(shí)，‘瑞都紅玫’果實(shí)中含量最高的6個(gè)化合物依次為里那醇、香葉醇、β-月桂烯、檸檬烯、β-cis-羅勒烯和α-萜品醇；貯藏45 d時(shí)，α-萜品醇含量降低而橙花醚含量升高成為主含量單萜。在整個(gè)低溫貯藏過(guò)程中，里那醇含量均最高。

28種游離態(tài)單萜含量在貯藏初期（15 d）均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在貯藏30 d后，包含里那醇在內(nèi)的大部分單萜含量持續(xù)下降，而香葉醇、香葉酸、橙花醇、香葉醛、香茅醛和橙花醛等單萜含量略有上升；貯藏后期（45 d），除了橙花醛，其他27種單萜含量表現(xiàn)上升趨勢(shì)（表 2）。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，在低溫貯藏過(guò)程中，‘瑞都紅玫’果實(shí)中游離態(tài)單萜含量變化趨勢(shì)主要聚為4類(lèi)（圖3-A）。第一類(lèi)包含β-月桂烯（M1）、水芹烯（M3）、(E, Z)-別羅勒烯（M11）、cis-呋喃型氧化里那醇（M12）、trans-呋喃型氧化里那醇（M13）、里那醇（M16）和β-香茅醇（M22），這一類(lèi)單萜在低溫貯藏過(guò)程中含量持續(xù)降低，到貯藏30 d時(shí)達(dá)到最低，貯藏后期略有上升。第二類(lèi)變化趨勢(shì)與第一類(lèi)相近，不同的是這類(lèi)化合物在低溫貯藏15 d后含量急劇下降，到貯藏中期（30 d）降至最低，貯藏45 d時(shí)含量明顯升高，這類(lèi)化合物包含檸檬烯（M2）、β-trans-羅勒烯（M4）、γ-松油烯（M5）、β-cis-羅勒烯（M6）、異松油烯（M7）、別羅勒烯（M10）、4-松油烯醇（M17）和α-萜品醇（M20）。第三類(lèi)有cis-氧化玫瑰（M8）、香茅醛（M15）、橙花醇（M24）、香葉醇（M27）和香葉酸（M28）等單萜，這類(lèi)單萜在貯藏初期（15 d）含量即降為最低，貯藏中后期含量上升，貯藏45 d時(shí)含量明顯升高。第四類(lèi)僅包含橙花醛（M18），盡管M18在貯藏初期含量也略有下降，但是與前3類(lèi)不同，該單萜在貯藏30 d時(shí)含量最高，貯藏45 d時(shí)含量最低。

在低溫貯藏過(guò)程中，主要糖苷結(jié)合態(tài)單萜組分差異不明顯，主要包括里那醇、β-月桂烯、香葉醇、香葉醛和β-cis-羅勒烯等單萜。在貯藏30 d時(shí)，β-月桂烯和香葉醇含量升高，高于結(jié)合態(tài)里那醇含量（表3）。大部分結(jié)合態(tài)單萜變化趨勢(shì)相似，貯藏初期（15 d）表現(xiàn)下降，中期（30 d）又有所上升，貯藏后期（45 d）急劇下降（表 3）。聚類(lèi)分析顯示結(jié)合態(tài)單萜在低溫貯藏過(guò)程中變化趨勢(shì)也主要聚為4類(lèi)（圖3-B）：第一類(lèi)有β-月桂烯（CM1）、檸檬烯（CM2）、水芹烯（CM3）、β-trans-羅勒烯（CM4）、γ-松油烯（CM5）、β-cis-羅勒烯（CM6）、別羅勒烯（CM10）、(E, Z)-別羅勒烯（CM11）、香茅醛（CM15）、α-衣蘭油烯（CM19）和γ-香葉醇（CM23），這類(lèi)糖苷結(jié)合態(tài)單萜在貯藏15 d時(shí)含量顯著下降，之后上升，到貯藏45 d又急劇下降到最低含量。第二類(lèi)結(jié)合態(tài)單萜包含異松油烯（CM7）、cis-呋喃型氧化里那醇（CM12）、trans-呋喃型氧化里那醇（CM13）、橙花醚（CM14）、里那醇（CM16）、4-松油烯醇（CM17）和α-萜品醇（CM20），這類(lèi)單萜在低溫貯藏過(guò)程中含量持續(xù)降低，沒(méi)有明顯的升高過(guò)程。第三類(lèi)結(jié)合態(tài)單萜在貯藏早期含量降低不明顯，在貯藏30 d時(shí)略有上升，到后期（45 d）急劇降到最低，這類(lèi)單萜包含橙花醛（CM18）、香葉醛（CM21）、β-香茅醇（CM22）、橙花醇（CM24）、cis-異香葉醇（CM25）和香葉醇（M27）。最后一類(lèi)僅包含香葉酸（CM28），在貯藏15 d時(shí)含量升高，之后逐漸降低。

在低溫貯藏過(guò)程中，‘瑞都紅玫’果實(shí)中游離態(tài)單萜總量呈現(xiàn)先下降后期略有升高的趨勢(shì)，游離態(tài)單萜占總單萜的比例也表現(xiàn)為先下降后期升高的趨勢(shì)（圖2）。而糖苷結(jié)合態(tài)單萜總量在貯藏初期（15 d）下降，貯藏30 d后又升高，之后又略有下降（圖2）。貯藏15 d后，糖苷結(jié)合態(tài)單萜含量高于游離態(tài)單萜含量。

2.4 低溫貯藏過(guò)程中‘瑞都早紅’果實(shí)中單萜化合物變化

在低溫貯藏過(guò)程中，‘瑞都早紅’果實(shí)中主要游離態(tài)單萜化合物組分改變不大。里那醇含量最高，其次是β-月桂烯，其他化合物含量高低略有變化（表2）。

大多數(shù)游離態(tài)單萜含量在低溫貯藏過(guò)程中呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示（圖 4-A），游離態(tài)單萜變化趨勢(shì)主要聚為 4類(lèi)：第一類(lèi)包含β-月桂烯（M1）、β-cis-羅勒烯（M6）、別羅勒烯（M10）、(E, Z)-別羅勒烯（M11）、里那醇（M16）、α-衣蘭油烯（M19）、香葉醛（M21）、β-香茅醇（M22）、γ-香葉醇（M23）和香葉醇（M27），這類(lèi)單萜含量在低溫貯藏過(guò)程中逐漸降低，到貯藏45 d降到最低。第二類(lèi)單萜有檸檬烯（M2）、水芹烯（M3）、β-trans-羅勒烯（M4）、γ-松油烯（M5）、異松油烯（M7）、cis-氧化玫瑰（M8）、cis-呋喃型氧化里那醇（M12）、trans-呋喃型氧化里那醇（M13）、香茅醛（M15）、橙花醇（M24）和香葉酸（M28），這類(lèi)化合物在貯藏早、中期含量上升，貯藏后期急劇下降，降到最低。第三類(lèi)包含4種單萜trans-氧化玫瑰（M9）、橙花醚（M14）、4-松油烯醇（M17）和α-萜品醇（M20），它們的含量在貯藏15 d或者貯藏30 d顯著升高，之后下降。第四類(lèi)單萜僅包含橙花醛（M18）一種化合物，該化合物在貯藏15 d含量顯著下降，之后逐漸升高。

在低溫貯藏前期和中期，‘瑞都早紅’果實(shí)中主要糖苷結(jié)合態(tài)單萜組分基本沒(méi)有變化，含量最高的化合物是里那醇，其次是β-月桂烯和香葉醇等單萜。到貯藏后期（45 d），里那醇含量下降，β-月桂烯和香葉醇含量升高，分別成為第一、二主含量單萜（表3）。低溫貯藏過(guò)程中糖苷結(jié)合態(tài)單萜含量變化趨勢(shì)主要聚為兩大類(lèi)（圖4-B）：第一類(lèi)包含β-月桂烯（CM1）、水芹烯（CM3）、β-trans-羅勒烯（CM4）、β-cis-羅勒烯（CM6）、別羅勒烯（CM10）、(E, Z)-別羅勒烯（CM11）、香茅醛（CM15）、γ-香葉醇（CM23）、cis-異香葉醇（CM25）、香葉醇（M27）；橙花醛（CM18）、香葉醛（CM21）、α-衣蘭油烯（CM19）、β-香茅醇（CM22）、橙花醇（CM24）、cis-異香葉醇（CM25）等單萜，這類(lèi)化合物在貯藏15 d時(shí)升高，之后下降，到貯藏45 d含量又有所回升。第二類(lèi)單萜主要有cis-氧化玫瑰（CM8）、trans-氧化玫瑰（CM9）、里那醇（CM16）、4-松油烯醇（CM17）、α-萜品醇（CM20）、異松油烯（CM7）、cis-呋喃型氧化里那醇（CM12）、trans-呋喃型氧化里那醇（CM13）、橙花醚（CM14）、香葉酸（CM28）、檸檬烯（CM2）、和γ-松油烯（CM5）等，這類(lèi)糖苷結(jié)合態(tài)單萜在貯藏前中期含量呈上升趨勢(shì)，到貯藏45 d時(shí)顯著下降。

在低溫貯藏過(guò)程中，‘瑞都早紅’果實(shí)中游離態(tài)單萜總量表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢(shì)，到貯藏45 d降到最低，僅為89.26 μg·L-1；糖苷結(jié)合態(tài)單萜總量在貯藏初期（15 d）升高，貯藏30 d后逐漸降低（圖2）。整個(gè)貯藏期間，游離態(tài)單萜占總單萜的比例逐漸降低，而糖苷結(jié)合態(tài)比例上升（圖2）。

2.5 低溫貯藏過(guò)程中兩個(gè)葡萄品種單萜化合物主成分分析

以不同貯藏時(shí)期2個(gè)葡萄品種游離態(tài)單萜定量數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析（圖5-A），從數(shù)據(jù)中提取了兩個(gè)主成分，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別解釋了75.6%和8.6%的變量信息，這兩個(gè)主成分占據(jù)了所有數(shù)據(jù)84.2%的變異，反映了化合物的絕大部分信息。在PC1方向，不同貯藏時(shí)間樣品可以得到很好地區(qū)分，貯藏初期（0 d）和后期（45 d）的‘瑞都紅玫’樣品位于第一象限，貯藏15 d和30 d樣品位于第二象限；而‘瑞都早紅’在貯藏后期（45 d）與其他時(shí)期明顯區(qū)分開(kāi)，位于第三象限。除了橙花醛（M18），其他游離態(tài)單萜含量與PC1均呈正相關(guān)。由圖5-A可見(jiàn)，對(duì)于 PC1，香葉酸（M28）、橙花醚（M14）、里那醇（M16）、4-松油烯醇（M17）、cis-呋喃型氧化里那醇（M12）和β-cis-羅勒烯（M6）等單萜載荷值較高，這些化合物在貯藏開(kāi)始（0 d）和后期（45 d）的‘瑞都紅玫’樣品中含量顯著高于貯藏15 d和30 d的樣品（表2）；在貯藏后期（45 d）‘瑞都早紅’樣品中的含量明顯低于其他3個(gè)時(shí)期樣品（表2）。這些單萜可以作為區(qū)分貯藏時(shí)期樣品的主要貢獻(xiàn)差異化合物成分。在PC2方向，兩個(gè)葡萄品種明顯區(qū)分開(kāi)，‘瑞都紅玫’樣品位于第一、二象限，而‘瑞都早紅’位于第三、四象限。在PC2中，cis-氧化玫瑰（M8）、橙花醛（M18）和trans-呋喃型氧化里那醇（M13）等游離態(tài)單萜載荷絕對(duì)值最高，其中M8和M13與PC2呈負(fù)相關(guān)?！鸲荚缂t’中這兩個(gè)單萜含量明顯高于‘瑞都紅玫’，而M18的含量低于‘瑞都紅玫’。這3個(gè)游離態(tài)單萜可以作為兩個(gè)品種區(qū)分的主要差異化合物。

以 2個(gè)葡萄品種不同貯藏時(shí)間糖苷結(jié)合態(tài)單萜定量數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析（圖5-B），從數(shù)據(jù)中也提取了兩個(gè)主成分，分別解釋了66.6%（PC1）和15.4%（PC2）的變量信息。根據(jù) PC1可以把兩個(gè)葡萄品種進(jìn)行很好的區(qū)分，‘瑞都紅玫’樣品位于第二、三象限，而‘瑞都早紅’樣品主要位于第一、四象限。在 PC1中，cis-氧化玫瑰（CM8）、trans-氧化玫瑰（CM9）、trans-異香葉醇（CM26）和β-香茅醇（CM22）等單萜載荷值較大，可以作為品種區(qū)分的主要差異物。根據(jù)PC2成分，兩個(gè)品種不同貯藏時(shí)期樣品也可以區(qū)分，‘瑞都紅玫’貯藏0 d和30 d樣品位于第二象限，而貯藏15 d和45 d樣品位于第三象限；‘瑞都早紅’貯藏30 d樣品明顯遠(yuǎn)離其他時(shí)期樣品。在PC2中，trans-異香葉醇（CM26）、γ-香葉醇（CM23）、cis-異香葉醇（CM25）和橙花醛（CM18）可以作為主要差異成分。

3 討論

單萜是葡萄果實(shí)中重要的異戊二烯衍生物，是玫瑰香型葡萄的典型香氣成分。研究表明，影響香氣成分積累的因素很多除了采前因素外，采后保鮮貯藏也會(huì)引起香氣的變化[6]。本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同品種果實(shí)中，盡管各個(gè)單萜含量存在顯著差異，但是主含量化合物成分相似。在‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’果實(shí)中，主要高含量游離態(tài)單萜有里那醇、β-月桂烯、檸檬烯和香葉醇等化合物，這與孫磊等[19]研究結(jié)果一致。這種單萜組分上的相似性可能是因?yàn)椤鸲技t玫’和‘瑞都早紅’均是從‘京秀’和‘香妃’雜交后代中選出的優(yōu)新品種，它們具有相似的遺傳背景[15-16]。此外，‘瑞都紅玫’中游離態(tài)單萜含量高于‘瑞都早紅’，孫磊等[19]也在‘瑞都紅玫’中檢測(cè)到高于‘瑞都早紅’的單萜含量，感官品嘗‘瑞都紅玫’的玫瑰香味比‘瑞都早紅’更加濃郁。盡管兩者游離態(tài)單萜總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于玫瑰香型釀酒葡萄被定義的濃度范圍（≥6 mg·L-1）[4]，但這兩個(gè)葡萄品種均具有不同程度的玫瑰香味，說(shuō)明鮮食葡萄可能存在不同的化合物濃度范圍。RUIZ-GARCíA 等[20]的研究表明，葡萄果實(shí)玫瑰香味與氧化玫瑰的有無(wú)相關(guān)，在所有玫瑰香型葡萄品種中都存在氧化玫瑰，而非玫瑰香型葡萄中都不存在氧化玫瑰，本研究在兩個(gè)品種中均檢測(cè)到不同濃度的游離態(tài)氧化玫瑰（表2）。

之前的一些研究表明玫瑰香型葡萄品種富含萜烯類(lèi)化合物，這些化合物在葡萄果實(shí)中主要以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在，這些結(jié)合態(tài)萜類(lèi)作為潛在的香味來(lái)源具有重要意義[21-22]。本研究首次對(duì)兩個(gè)品種葡萄果實(shí)中糖苷結(jié)合態(tài)單萜進(jìn)行了定性定量分析，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)葡萄品種中大部分糖苷結(jié)合態(tài)單萜含量明顯高于游離態(tài)，說(shuō)明單萜在這兩種葡萄果實(shí)中也主要以結(jié)合態(tài)形式存在。兩個(gè)葡萄品種果實(shí)中高含量糖苷結(jié)合態(tài)單萜組分相似，含有里那醇、β-月桂烯和香葉醇等，這與上述游離態(tài)結(jié)果相似。FENOLL等[23]在‘玫瑰香’葡萄果實(shí)中也檢測(cè)到高含量的糖苷結(jié)合態(tài)里那醇和香葉醇，此外，香茅醇和橙花醇含量也較高，與本研究結(jié)果略有不同。成熟的‘陽(yáng)光玫瑰’果實(shí)中也檢測(cè)到高含量的里那醇和香葉醇，但是并未檢測(cè)到β-月桂烯[24]。此外，之前的研究表明釀酒葡萄果實(shí)中糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量是游離態(tài)的 2—8倍[25]，但是本研究發(fā)現(xiàn)在鮮食葡萄果實(shí)中存在不同的組成比例，這可能與葡萄品種、果實(shí)成熟度和栽培模式等有關(guān)。甚至在‘瑞都紅玫’果實(shí)中，里那醇、異松油烯和氧化玫瑰等6種單萜游離態(tài)含量高于結(jié)合態(tài)含量，而高含量的游離態(tài)單萜更容易被感知，從而增強(qiáng)香味的濃郁程度。WU等[24]在鮮食葡萄‘陽(yáng)光玫瑰’果實(shí)中也檢測(cè)到較高含量的游離態(tài)異松油烯、氧化玫瑰和脫氫芳樟醇等單萜。

低溫貯藏過(guò)程中，‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’中的大部分游離態(tài)單萜或早或晚出現(xiàn)含量降低的趨勢(shì)。之前的研究指出低溫貯藏是能夠最大限度保持葡萄果實(shí)品質(zhì)的有效技術(shù)，但是隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致果實(shí)香味改變或香味喪失[26-27]。貯藏溫度和時(shí)間會(huì)對(duì)揮發(fā)性香氣成分產(chǎn)生顯著影響[28-30]。單萜化合物含量之間存在較高的相關(guān)性[31]，本研究中同一類(lèi)化合物變化趨勢(shì)相似。β-月桂烯、里那醇和cis-呋喃氧化里那醇等聚為一類(lèi)；氧化玫瑰、香葉醇和香葉酸等聚為一類(lèi)；而異油松烯和α-萜品醇等單萜聚在一起，這與釀酒葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中各個(gè)單萜聚類(lèi)結(jié)果相似[5]，可能與同一類(lèi)單萜具有相同或者相近的合成代謝途徑相關(guān)[3]。但是各個(gè)游離態(tài)單萜在兩個(gè)品種中的變化趨勢(shì)不盡相同，如主含量單萜里那醇、β-月桂烯和β-香茅醇（M22）等在兩個(gè)品種中雖然都聚在第一類(lèi)，但在‘瑞都紅玫’中貯藏30 d時(shí)含量降為最低，在45 d時(shí)含量又有所回升；‘瑞都早紅’則在45 d降為最低。橙花醇（M24）和香葉醇（M27）等化合物在‘瑞都紅玫’中貯藏15 d時(shí)含量即降為最低，之后含量又逐漸升高，而在‘瑞都紅玫’中貯藏15 d時(shí)含量升高，之后隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低；cis-氧化玫瑰（M8）在兩個(gè)品種中也表現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，這些差異可能與兩個(gè)品種具有不同的低溫耐貯性相關(guān)。MORALES等[32]也發(fā)現(xiàn)不同品種樹(shù)莓在低溫貯藏過(guò)程中，里那醇、香葉醇和α-萜品醇等游離態(tài)單萜存在相反的變化模式。在不同品種柑橘低溫貯藏過(guò)程中，單萜也呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)[33]。28種游離態(tài)單萜在兩個(gè)品種低溫貯藏過(guò)程中的變化有特性也有共性。主成分分析結(jié)果顯示兩個(gè)品種葡萄中香葉酸（M28）、橙花醚（M14）、里那醇（M16）和4-松油烯醇（M17）等游離態(tài)單萜在低溫貯藏過(guò)程中含量差異明顯，在PC1中具有高的荷載值，這些游離態(tài)單萜可以作為區(qū)分不同貯藏時(shí)間樣品的主要貢獻(xiàn)單萜成分。

糖苷結(jié)合態(tài)單萜低溫貯藏過(guò)程中的變化模式與游離態(tài)單萜表現(xiàn)不同，其中總糖苷結(jié)合態(tài)單萜的含量和比例與游離態(tài)單萜呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵诘蜏刭A藏過(guò)程中糖苷結(jié)合態(tài)和游離態(tài)單萜之間發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化。MATSUMOTO和IKOMA[14]指出采后貯藏過(guò)程中貯藏溫度和時(shí)間可能影響萜類(lèi)化學(xué)或酶水解反應(yīng)，導(dǎo)致各種單萜含量波動(dòng)差異。糖苷結(jié)合態(tài)單萜在‘瑞都紅玫’中變化趨勢(shì)聚為4類(lèi)，在‘瑞都早紅’則聚為兩大類(lèi)。LI等[5]在兩種不同釀酒葡萄中也發(fā)現(xiàn)不同的結(jié)合態(tài)單萜聚類(lèi)模式，可能與不同品種中單萜糖基轉(zhuǎn)移酶活性差異有關(guān)。隨著低溫貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，包含高含量單萜里那醇、β-月桂烯和香葉醇等各個(gè)糖苷結(jié)合態(tài)單萜呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，表現(xiàn)出品種特異性。說(shuō)明相較于貯藏條件，品種對(duì)于糖苷結(jié)合態(tài)單萜影響更大。隨后的主成分分析進(jìn)一步印證了這一結(jié)果，在 PC1方向上兩個(gè)品種可以進(jìn)行很好的區(qū)分。RUIZ-GARCíA 等[20]的研究曾指出氧化玫瑰可以作為品種有無(wú)玫瑰香味的標(biāo)記物。本研究也發(fā)現(xiàn)在PC1中，糖苷結(jié)合態(tài)cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰都具有較高的荷載值，說(shuō)明該化合物也可以作為區(qū)分兩個(gè)品種的主要標(biāo)記物。

4 結(jié)論

‘瑞都紅玫’的低溫耐貯性?xún)?yōu)于‘瑞都早紅’。兩個(gè)鮮食葡萄品種中的主含量單萜化合物組分相近，主要游離態(tài)單萜包含有里那醇、β-月桂烯、β-cis-羅勒烯、檸檬烯、cis-呋喃型氧化里那醇和香葉醇等；主要糖苷結(jié)合態(tài)單萜包括里那醇、β-月桂烯、香葉醇、香葉醛、β-cis-羅勒烯和橙花醚等?！鸲技t玫’中單萜含量高于‘瑞都早紅’。在低溫貯藏過(guò)程中，游離態(tài)單萜含量呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，主要呈現(xiàn)4種變化模式；相較于低溫貯藏初期，大部分游離態(tài)單萜單萜含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。香葉酸（M28）、橙花醚（M14）、里那醇（M16）和 4-松油烯醇（M17）等游離態(tài)單萜可以作為不同貯藏時(shí)間樣品區(qū)分的主要貢獻(xiàn)單萜成分。在貯藏過(guò)程中，總糖苷結(jié)合態(tài)單萜的含量與游離態(tài)單萜呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，各個(gè)糖苷結(jié)合態(tài)單萜的變化趨勢(shì)因品種而不同。氧化玫瑰可以作為區(qū)分兩個(gè)品種的主要標(biāo)記物。