張隴艷，程功敏，魏恒玲，王寒濤，蘆建華，馬峙英，喻樹迅?

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000

0 引言

【研究意義】棉花（Gossypium hirsutumL.）原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，低溫冷害是限制其品種產(chǎn)區(qū)分布的重要環(huán)境因素[1]。中國的棉花產(chǎn)區(qū)主要分布于長(zhǎng)江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸地區(qū)[2]。由于糧棉爭(zhēng)地矛盾日益加深，棉花種植區(qū)域逐步向西北內(nèi)陸等瘠寒地區(qū)拓展[3]。低溫冷害是棉花西進(jìn)和北上拓展所面臨的重要非生物脅迫之一，在播種出苗階段，低溫冷害輕則延遲種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育，重則降低出苗率和幼苗的存活率[4-6]。因此，鑒定和篩選吸脹萌發(fā)期耐冷品種、探究棉花吸脹萌發(fā)期耐冷性機(jī)理，可以為耐冷性遺傳改良，以及棉花生產(chǎn)區(qū)域拓展提供重要依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉花為雙子葉植物，種子包含有胚乳層，萌發(fā)首先從種子吸脹開始[7]。雙子葉植物種子萌發(fā)需要完成種皮破裂(testa rupture)和胚乳層破裂(endosperm rupture)2個(gè)物理過程，胚根從破裂的珠孔胚乳層處出現(xiàn)標(biāo)志著萌發(fā)的結(jié)束，擬南芥（Arabidopsis thaliana）萌發(fā)階段分別以種皮破裂和胚乳層破裂作為前期和后期萌發(fā)結(jié)束的標(biāo)志[8-9]。在一些研究中，棉花種子萌發(fā)期的非生物脅迫鑒定通常還包括胚根突破胚乳層到胚芽伸長(zhǎng)這個(gè)階段。植物萌發(fā)期和幼苗期面臨的低溫脅迫通常是有別于凍害溫度（＜0℃）的非結(jié)冰溫度（0—15℃）[10]；棉花萌發(fā)最低溫度為10—12℃，最適溫度為 20—30℃[3,11-12]。針對(duì)植物萌發(fā)期耐冷性鑒定，國內(nèi)外研究人員從生理生化和形態(tài)指標(biāo)等方面進(jìn)行廣泛的研究。陳昊等[13]采用吸水速率、相對(duì)吸水量和相對(duì)發(fā)芽率等指標(biāo)對(duì) 64份花生材料進(jìn)行吸脹萌發(fā)階段的耐冷性鑒定，發(fā)現(xiàn)冷脅迫能降低吸脹速率，吸脹階段冷處理 12 h可以區(qū)分不同種質(zhì)間抗冷性差異；李霞等[14]通過測(cè)定吸脹階段的吸水速率、電導(dǎo)率、脫氫酶和α-淀粉酶活性及發(fā)芽指標(biāo)研究不同耐冷基因型玉米對(duì)低溫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)冷敏感玉米籽粒吸脹迅速且電導(dǎo)率相對(duì)增大，而耐冷性吸脹緩慢。HUANG等[10]利用萌發(fā)率和胚芽數(shù)指標(biāo)來鑒定 125份玉米自交系的萌發(fā)期耐冷性，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)期指標(biāo)具有顯著正相關(guān)（R＝0.41），而萌發(fā)期和幼苗期指標(biāo)之間相關(guān)性不顯著（-0.05≤R≤0.16）。SCHL?PPI等[15]采用低溫發(fā)芽力和低溫胚芽生長(zhǎng)速率指標(biāo)對(duì) 202份水稻品種萌發(fā)期進(jìn)行耐冷性鑒定，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)期指標(biāo)彼此相關(guān)性較高，而其與幼苗期耐冷指標(biāo)不相關(guān)或相關(guān)性較弱。以上研究表明，在作物的不同生育時(shí)期，其耐冷性存在差異。在棉花耐冷性形態(tài)指標(biāo)鑒定方面，高利英[16]利用發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等萌發(fā)期指標(biāo)對(duì)38份陸地棉材料進(jìn)行耐冷性鑒定和綜合評(píng)價(jià)；王俊娟[17]利用低溫萌發(fā)后的子葉平展率作為萌發(fā)期低溫鑒定的指標(biāo)對(duì) 13份陸地棉品種進(jìn)行耐冷性鑒定。在棉花耐冷性生理生化指標(biāo)鑒定方面，武輝等[18]測(cè)定了低溫脅迫下15份陸地棉材料幼苗葉片的光合參數(shù)及葉綠素、可溶性糖、丙二醛和游離脯氨酸含量以及相對(duì)電導(dǎo)率等12項(xiàng)生理指標(biāo)，采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐冷性綜合評(píng)價(jià)；李志博等[19]測(cè)定了 4份耐冷性不同的北疆主栽陸地棉品種低溫脅迫下的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）酶活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、可溶性蛋白、可溶性糖含量，通過回歸分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)CAT酶活性、相對(duì)MDA和可溶性蛋白含量與棉花幼苗耐冷性密切相關(guān)；夏軍等[20]發(fā)現(xiàn)耐冷棉花材料中SOD、POD和CAT酶活性在低溫脅迫下比冷敏感材料的要高；高利英等[21]發(fā)現(xiàn)在不同冷處理水平下耐冷棉花中SOD和POD酶活性均能保持較高水平，而在耐冷材料中CAT酶活性會(huì)逐漸超越冷敏感品種。棉花萌發(fā)期耐冷性是復(fù)雜的綜合性狀，僅依靠單一的指標(biāo)很難篩選到抗冷性綜合性能強(qiáng)的材料。因此，近年來基于因子分析和主成分分析的隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)方法在棉花萌發(fā)期非生物脅迫鑒定方面得到了廣泛的應(yīng)用，這對(duì)棉花吸脹萌發(fā)階段的耐冷性鑒定提供了很大的幫助[22-24]。【本研究切入點(diǎn)】盡管前人對(duì)棉花萌發(fā)期的耐冷性多有研究，但是由于試驗(yàn)材料、鑒定指標(biāo)和鑒定方法的局限性而不能對(duì)吸脹萌發(fā)階段的耐冷性有全面和深入的認(rèn)識(shí)。因此，利用綜合評(píng)價(jià)方法系統(tǒng)考察吸脹期和萌發(fā)期的耐冷性關(guān)系，并且從生理和分子水平對(duì)綜合評(píng)價(jià)所得的不同抗冷基因型材料進(jìn)行研究，必然會(huì)為深入理解棉花吸脹萌發(fā)期耐冷性機(jī)理和遺傳改良提供幫助。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)主要來自黃河流域和西北內(nèi)陸棉區(qū)的53份陸地棉材料進(jìn)行室內(nèi)低溫萌發(fā)鑒定，綜合評(píng)價(jià)材料的吸脹萌發(fā)期耐冷性。研究差異材料低溫脅迫處理下抗氧化物酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度及抗氧化物酶基因表達(dá)規(guī)律，明確之前未知的一些供試材料的耐冷特性，為深入解析棉花抗冷機(jī)理與鑒定耐冷種質(zhì)以及育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用56份陸地棉常規(guī)栽培品種（系）作為試驗(yàn)材料，所有材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所早熟育種實(shí)驗(yàn)室提供。其中，用于萌發(fā)期耐冷性鑒定的 53份材料包括黃河流域材料28份、長(zhǎng)江流域材料2份和西北內(nèi)陸棉區(qū)材料23份，材料名稱及詳細(xì)信息見電子附表1。

1.2 試驗(yàn)方法

每個(gè)材料選取飽滿種子100粒，3個(gè)重復(fù)，稱重后在4℃和25℃條件下分別吸脹0和6 h，拭去種子表面水分后分別再次稱重，計(jì)算不同溫度下的吸脹速率。其中，中50、中425和中915均吸脹12 h，每小時(shí)稱重一次，參考前人方法計(jì)算相對(duì)吸水量和吸水速率[13]。從每個(gè)品種（系）中挑選400粒飽滿種子，清水沖洗干凈后置于25℃浸泡12 h。挑選已完成吸脹的種子（外種殼的珠孔處開裂并露出白色胚乳層）各100粒，拭去其表面水分并稱重，然后均勻地平鋪到墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，設(shè)3個(gè)重復(fù)。置入12℃冷光源培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗萌發(fā)12 d。每天準(zhǔn)時(shí)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)種子數(shù)，萌發(fā)以胚根頂破珠孔處的胚乳層并伸出 2—3 mm為標(biāo)準(zhǔn)。低溫萌發(fā)12 d后，人工將種胚的芽和胚用鑷子分離并分別稱鮮重，烘干后分部稱干重，得到低溫萌發(fā)后芽和胚的鮮重及干重。

分別從新陸中4號(hào)和中103026中挑選200粒飽滿的種子，25℃清水浸泡12 h后沖洗3—5遍，挑選露白種子各50粒均勻平鋪到墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃冷光源培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)24 h。分別從每個(gè)材料的50粒種子中挑選30粒萌發(fā)一致的種子，將種子均勻平鋪到墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于 4℃冷光源培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)24 h。在低溫處理0、3、6、12和24 h時(shí)分別取出3粒種子，去除外種殼及胚乳層后投入液氮冷凍保存，另外在0、12和24 h時(shí)分別取出3粒種子用于生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo) 根據(jù)吸脹前后及萌發(fā)前后的種子重量，以及每天統(tǒng)計(jì)的各品種（系）的萌發(fā)種子數(shù)，利用以下公式或方法計(jì)算各個(gè)指標(biāo)值：

種子吸脹速率（imbibition rate，IR）：IR=(B-A)/A×100%，式中，A、B分別為吸水前和吸水后的種子質(zhì)量[25]；

相對(duì)吸脹速率（relative imbibition rate，RIR）：RIR=低溫吸脹速率/常溫吸脹速率；

物質(zhì)增長(zhǎng)率（material growth rate，MGR）：MGR=(M2-M1)/M1。式中M1、M2分別為吸脹結(jié)束后百粒鮮重和萌發(fā)結(jié)束后百粒鮮重；

物質(zhì)效率（productive efficiency，PE）：PE=m2/(m1-m2)。式中，m1、m2分別為吸脹前百粒重和萌發(fā)結(jié)束后百粒重；

發(fā)芽率（germination rate，GR）：GR=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。試驗(yàn)中選擇低溫萌發(fā)第7天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率[22]；

發(fā)芽勢(shì)（germination potential，GP）：GP=發(fā)芽達(dá)到高峰期時(shí)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%，本試驗(yàn)中選擇低溫萌發(fā)第5天調(diào)查種子發(fā)芽勢(shì)[26]；

發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）：GI=∑(Gt/Dt)。式中Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為至t天的發(fā)芽天數(shù)（d）[22]；

活力指數(shù)（vigor index，VI）：VI=S×GI。式中S為萌發(fā)種子鮮質(zhì)量，GI為發(fā)芽指數(shù)[22]；

平均發(fā)芽時(shí)間（mean germination time，MGT）：MGT=∑(Gt×Tt)/∑Gt。式中，Gt為在不同時(shí)間的發(fā)芽數(shù)，Tt為發(fā)芽日數(shù)[27]；

平均發(fā)芽速度（average germination speed，AGS）：AGS=(∑Dn)/∑n。D為種子放置到培養(yǎng)皿后算起的天數(shù)，n為相應(yīng)各天發(fā)芽種子數(shù)[28]；

種子萌發(fā)指數(shù)（seed germination coefficient，SGC）：SGC=1.00×nd2+0.75×nd4+0.50×nd6+0.25×nd8。nd2、nd4、nd6、nd8分別指第2、4、6和8天的種子發(fā)芽率[26]。

以上指標(biāo)涉及重量的測(cè)定，主要用到ME104E電子分析天平（上海梅特勒-托利多）及JY2002電子天平（上海衡平）。

1.3.2 生理指標(biāo) 將4℃處理0、12和24 h的去殼萌發(fā)種子樣品按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒說明進(jìn)行預(yù)處理，測(cè)定SOD、POD和CAT 3種抗氧化物酶活性，同時(shí)檢測(cè)樣品中可溶性蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、因子分析、相關(guān)性分析和主成分分析，運(yùn)用R語言進(jìn)行聚類分析，圖片利用Excel和R軟件繪制。使用模糊隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)各材料種子萌發(fā)期耐冷性的差異，各個(gè)值的計(jì)算方法分別為：

隸屬函數(shù)值：μ(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，i=1，2，...，n。式中，Xi為第i個(gè)綜合指標(biāo)，Xmin為第i個(gè)綜合指標(biāo)的最小值，Xmax為第i個(gè)綜合指標(biāo)的最大值[29]。

綜合指標(biāo)權(quán)重：wi=pi/∑pi，i=1，2，...，n。式中，wi為第i個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的權(quán)重，pi為各品種第i個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率[18]。

綜合評(píng)價(jià)值：D=∑[μ(Xi)×wi]，i=1，2，...，n。式中，D值為各材料在冷害脅迫條件下用綜合指標(biāo)計(jì)算所得的耐冷性綜合評(píng)價(jià)值[18]。

1.5 抗氧化物酶基因的表達(dá)分析

1.5.1 種子RNA的提取和檢測(cè) 將4℃處理0、3、6、12和24 h的去殼萌發(fā)種子樣品按照RNApre Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）說明方法提取胚根和子葉中的總RNA，利用1% agarose凝膠檢測(cè)其完整性，120 V電泳20 min。

1.5.2 cDNA的合成 利用 TaKaRa的 PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行（寶生物，大連）反轉(zhuǎn)錄。該試劑盒反應(yīng)分2步進(jìn)行：去除RNA樣品中殘留的基因組DNA（gDNA）；cDNA單鏈合成（所有操作都需在冰上進(jìn)行）。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置到-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析 利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因和抗氧化物酶基因的熒光定量引物。qRT-PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7500儀器中進(jìn)行，體系采用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq（2×）試劑盒。反應(yīng)結(jié)束后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，使用 2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 低溫冷害對(duì)棉花種子吸脹的影響

為了研究低溫冷害對(duì)棉花種子萌發(fā)期吸脹階段的影響，分別測(cè)定3份陸地棉栽培品種在常溫（25℃）和低溫（4℃）條件下0—12 h的相對(duì)吸水量和吸水速率（圖1）。與常溫相比，中50、中425和中915在低溫下吸脹12 h后相對(duì)吸水量分別只達(dá)到常溫的76.44%、78.93%和 71.90%。常溫條件下，中 50、中425和中915分別在3、2和4 h達(dá)到最大吸水速率（分別達(dá)到1.1408、1.5156和0.8566 g·h-1）；低溫條件下，其最大吸水速率分別出現(xiàn)在7、2和4 h時(shí)，僅達(dá)到0.5367、0.8041和0.5049 g·h-1。說明低溫能夠顯著降低棉花種子萌發(fā)期吸脹階段的相對(duì)吸水量和吸水速率。

2.2 棉花萌發(fā)期耐冷性指標(biāo)的差異

常溫（25℃）條件下的萌發(fā)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，完成吸脹后所有材料的露白種子（外種殼珠孔處開裂并露出白色胚乳層）在一天之內(nèi)均可悉數(shù)萌發(fā)，說明選擇露白種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)?zāi)軌蛳牧现g除溫度因素以外的所有差異，因此，低溫下相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)就能直接地反映不同材料的耐冷性強(qiáng)弱。這些指標(biāo)中，低溫種子吸脹速率和相對(duì)吸脹速率被用來反映棉花吸脹階段的耐冷性，低溫物質(zhì)增長(zhǎng)率、物質(zhì)效率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間、平均發(fā)芽速度、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、種子萌發(fā)指數(shù)、芽鮮重、芽干重、胚鮮重、胚干重被用來反映萌發(fā)階段耐冷性。從表1可以看出同指標(biāo)在不同材料間存在較大變幅，其中低溫吸脹速率變化幅度為 0.07%—0.62%，低溫相對(duì)吸脹速率變化幅度為 0.24%—1.00%，芽鮮重變化幅度為0.31%—4.06%，胚鮮重變化幅度為 13.11%—24.17%，芽干重變化幅度為0.09%—0.65%，胚干重變化幅度為5.89%—11.93%，物質(zhì)增長(zhǎng)率變化幅度為 0.01%—0.24%，物質(zhì)效率變化幅度為0.04%—0.35%，平均發(fā)芽速度變化幅度為5.10%—10.55%，發(fā)芽指數(shù)變化幅度為2.34%—19.99%，活力指數(shù)變化幅度為 0.86%—78.31%，平均發(fā)芽時(shí)間變化幅度為4.99%—10.18%，發(fā)芽勢(shì)變化幅度為 0.00—0.82%，發(fā)芽率變化幅度為0.03%—1.00%，種子萌發(fā)指數(shù)變化幅度為0.07%—1.72%。53份陸地棉材料間的各個(gè)萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的變異系數(shù)也存在差異，其中，發(fā)芽勢(shì)（CV=1.235）和活力指數(shù)（CV=0.551）的變異系數(shù)最高，而胚鮮重（CV=0.130）和胚干重（CV=0.141）的變異系數(shù)最低，說明各個(gè)耐冷指標(biāo)對(duì)材料基因型的依賴性不同。由于各個(gè)萌發(fā)期耐冷指標(biāo)反映的信息可能存在重疊，因此，有必要進(jìn)行指標(biāo)間的相關(guān)性分析。

2.3 主成分分析

表1 不同棉花材料萌發(fā)期各耐冷指標(biāo)的差異Table 1 Differences in chilling-tolerance indices of different cottons at germination stage

表2 萌發(fā)期各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 2 Coefficients and contribution of comprehensive indexes at germination stage

主成分分析可以將多維變量簡(jiǎn)化為少數(shù)幾個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)。15個(gè)萌發(fā)期單項(xiàng)耐冷指標(biāo)的主成分分析結(jié)果見表2，以特征值大于1為閾值共得到3個(gè)主成分，對(duì)應(yīng)的特征根分別為2.877、1.656和1.148，其貢獻(xiàn)率分別為55.17%、18.27%和8.79%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到82.23%，說明這3個(gè)主成分能夠解釋絕大部分信息，而其余成分最大貢獻(xiàn)率僅為6.723%，可忽略不計(jì)。這樣就將原來的15個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)獨(dú)立的綜合指標(biāo)，命名為CI1、CI2和CI3，而這 3項(xiàng)綜合指標(biāo)代表了原有單項(xiàng)指標(biāo)的耐冷信息。其中，第一主成分CI1的特征向量主要描述的是活力指數(shù)（0.335）、低溫萌發(fā)指數(shù)（0.333）、平均發(fā)芽速度（-0.333）、發(fā)芽指數(shù)（0.331）、平均發(fā)芽時(shí)間（-0.330）、發(fā)芽率（0.321）、芽鮮重（0.315）、芽干重（0.284）、物質(zhì)增長(zhǎng)率（0.258）和發(fā)芽勢(shì)（0.238）；第二主成分CI2的特征向量主要描述的是胚干重（0.516）和胚鮮重（0.490）；第三主成分CI3的特征向量主要描述的是低溫吸脹速率（0.481）、相對(duì)吸脹速率（0.632）和物質(zhì)效率（-0.553）。

2.4 品種綜合評(píng)價(jià)

2.4.1 隸屬函數(shù)分析 按照隸屬函數(shù)計(jì)算公式求得各品種綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值（表 3）。對(duì)于同一綜合指標(biāo)如CI1來說，棉花萌發(fā)期的各品種在低溫條件下，新陸中 4號(hào)的隸屬函數(shù)值μ(X1)最大（1.000），說明在此綜合指標(biāo)下其萌發(fā)期耐冷性最強(qiáng)；中103026的隸屬函數(shù)值μ(X1)最?。?.000），說明在此綜合指標(biāo)下其萌發(fā)期耐冷性在最差。對(duì)于綜合指標(biāo)CI3來說，中 679的隸屬函數(shù)值μ(X1)最大（1.000），說明在此綜合指標(biāo)下其萌發(fā)期耐冷性最強(qiáng)；品種川01的隸屬函數(shù)值μ(X1)最?。?.000），說明在此綜合指標(biāo)下其萌發(fā)期耐冷性最差。根據(jù)綜合指標(biāo)權(quán)重公式以及各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率可計(jì)算得到3個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重，分別為6.532、4.427和2.641（表3）。

2.4.2 綜合評(píng)價(jià)及聚類分析 按照綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)公式計(jì)算各棉花品種（系）萌發(fā)期耐冷性綜合指標(biāo)值（表3），并根據(jù)求得的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)D值對(duì)53份材料的耐冷性進(jìn)行排序，采用最大距離法對(duì)綜合指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，依據(jù)D值大小及聚類結(jié)果可將材料劃分為4類（圖2）。新陸中4號(hào)、中棉所14等5份材料為第一類（Ⅰ），占供試材料總數(shù)的 9.43%，屬于低溫萌發(fā)強(qiáng)耐冷型。新陸中20號(hào)、黑山棉1號(hào)等13份材料為第二類（Ⅱ），占材料總數(shù)的24.53%，屬于低溫萌發(fā)耐冷型。新陸中14號(hào)、邯2490、新陸中60號(hào)等26份材料為第三類（Ⅲ），占總材料的49.05%，屬于低溫萌發(fā)不耐冷型。新陸中34號(hào)、新陸中28號(hào)、川01等9份材料為第四類（Ⅳ），占材料總數(shù)的16.98%，屬于低溫萌發(fā)冷敏感型。從比例來看，耐冷品種（系）比較少，說明獲得棉花萌發(fā)期耐冷性種質(zhì)的來源途徑比較狹窄且多數(shù)材料適合在更溫暖的季節(jié)播種。在這53份陸地棉材料中，新陸中4號(hào)的萌發(fā)期耐冷綜合指標(biāo)值最高（D=0.938），而中103026的萌發(fā)期耐冷綜合指標(biāo)值最低（D=0.166），因此，選擇這兩份萌發(fā)期耐冷性存在顯著差異的材料用于后續(xù)生理水平的研究。

表3 各品種的綜合指標(biāo)值、權(quán)重、μ(X)、D值及綜合評(píng)價(jià)Table 3 Value of each comprehensive index (CI), index weight, μ(X), and comprehensive evaluation value (D value)

續(xù)表3 Continued table 3

2.5 棉花萌發(fā)期耐冷性指標(biāo)的相關(guān)性分析

萌發(fā)期耐冷性指標(biāo)間的相關(guān)性如圖3所示，低溫萌發(fā)后胚鮮重、胚干重、芽干重、芽鮮重、活力指數(shù)間呈極顯著正相關(guān)，其中，胚鮮重與胚干重間（R=0.96）、芽干重與芽鮮重間（R=0.94）、芽鮮重與活力指數(shù)間（R=0.96）相關(guān)性都較高。芽干重、芽鮮重、活力指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)、物質(zhì)增長(zhǎng)率、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子萌發(fā)指數(shù)間呈極顯著正相關(guān)，其中除芽干重、芽鮮重、活力指數(shù)間相關(guān)性較高外，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子萌發(fā)指數(shù)間相關(guān)性也較高（R=0.94—0.96），它們與平均發(fā)芽速度和平均發(fā)芽時(shí)間呈極顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.98—-0.67）。種子低溫吸脹速率與低溫相對(duì)吸脹速率間呈極顯著正相關(guān)（R=0.58），它們與其他萌發(fā)指標(biāo)間的相關(guān)性不顯著或負(fù)相關(guān)。這說明萌發(fā)期的吸脹階段與其他階段可能具有不同的耐冷機(jī)制，而萌發(fā)階段的指標(biāo)所反映的耐冷信息具有重疊性。耐冷性綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)（D值）與胚鮮重、胚干重、芽干重、芽鮮重、活力指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)、物質(zhì)增長(zhǎng)率、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子萌發(fā)指數(shù)間均呈極顯著正相關(guān)（R=0.60—0.95），其中，與芽干重、芽鮮重、活力指數(shù)之間的相關(guān)性最強(qiáng)（分別為R=0.88、R=0.92和R=0.95），與平均發(fā)芽速度、平均發(fā)芽時(shí)間之間呈極顯著負(fù)相關(guān)（R=0.83）。這說明芽干重、芽鮮重、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速度、平均發(fā)芽時(shí)間能較好反映不同棉花材料萌發(fā)期的耐冷性強(qiáng)弱。

2.6 生理指標(biāo)分析

由圖4可知，在對(duì)2個(gè)棉花材料的萌發(fā)期種子進(jìn)行冷脅迫處理后，耐冷材料新陸中4號(hào)在處理12 h時(shí)的SOD、POD和CAT酶活性均降到最低，而在脅迫24 h時(shí)又有所上升。對(duì)于冷敏感材料來說，SOD、POD和CAT酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并且在處理前和處理24 h時(shí)均顯著地低于耐冷材料的酶活性。冷處理12 h后，冷敏感材料中的SOD和CAT 2種抗氧化物酶活性均顯著高于耐冷材料，而POD酶活性在兩種材料間差異不顯著。這說明棉花在萌發(fā)期進(jìn)行低溫脅迫后，耐冷材料種子的SOD、POD和CAT酶活性能夠在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)到接近對(duì)照的水平或超過對(duì)照，這些特性均有利于耐冷材料萌發(fā)期的種子在面臨冷脅迫時(shí)通過有效地降低活性氧積累對(duì)機(jī)體造成的傷害，因此，耐冷材料表現(xiàn)出比冷敏感材料更強(qiáng)的耐低溫萌發(fā)能力。對(duì)于可溶性蛋白濃度而言，耐冷材料的可溶性蛋白濃度始終顯著高于冷敏感材料，并且可溶性蛋白的含量均呈增加趨勢(shì)。這說明耐冷材料在萌發(fā)期能維持較高的可溶性蛋白濃度，在受到低溫脅迫后不同耐冷性材料的種子都會(huì)借助增加可溶性蛋白濃度而增強(qiáng)其自身抵御低溫傷害的能力。

2.7 抗氧化物酶基因的表達(dá)量分析

由圖5可知，萌發(fā)期的種子受到低溫脅迫12 h后，SOD酶基因GhCSD1在兩材料子葉中均下調(diào)表達(dá)，低溫脅迫24 h時(shí)在耐冷材料中表達(dá)量迅速上調(diào)，而在冷敏感材料中保持持續(xù)下調(diào)趨勢(shì)，且在耐冷材料中的表達(dá)量均顯著地高于冷敏感材料，這與SOD酶活性的變化基本一致。POD酶基因GhPrx53在低溫脅迫0—24 h，在耐冷材料中的表達(dá)量始終高于冷敏感材料，這與過氧化物酶的活性變化相一致。在胚根遭受低溫脅迫0—12 h，GhCSD1在兩材料中的表達(dá)量均維持在較低水平，但是在耐冷材料中其表達(dá)量始終高于冷敏感材料；冷脅迫24 h時(shí)，在冷敏感材料中的表達(dá)量顯著地高于耐冷材料，說明在種子的子葉和胚根中GhCSD1的表達(dá)趨勢(shì)有所差異，而POD酶基因GhPrx53的表達(dá)趨勢(shì)與子葉中的基本一致。在低溫脅迫前后，POD酶基因的表達(dá)量在耐冷材料的子葉和胚根中的表達(dá)量都遠(yuǎn)高于冷敏感性材料子葉和胚根中的表達(dá)量，說明兩材料萌發(fā)期的耐冷性很可能與二者自身間的遺傳背景差異有關(guān)。

3 討論

3.1 低溫冷害對(duì)棉花種子萌發(fā)期相關(guān)性狀的影響

溫度是影響棉花種子萌發(fā)的重要環(huán)境因素，溫度過低會(huì)嚴(yán)重影響種子的萌發(fā)率和出苗率。研究表明，棉花種子萌發(fā)的最低溫度為 10—12℃，溫度低于 10℃時(shí)棉花種子不能萌發(fā)[12,30]。不同溫度條件下材料間種子萌發(fā)鑒定結(jié)果可能會(huì)不同，說明不同溫度影響種子萌發(fā)的機(jī)制存在差異[12]。植物的耐冷性是一種受多基因調(diào)控的復(fù)雜數(shù)量性狀[31]。冷脅迫下不同棉花品種在種子萌發(fā)期的表現(xiàn)存在差異[32]，遺傳背景的差異往往決定種子萌發(fā)期的耐冷性。棉花萌發(fā)期的耐冷機(jī)制的研究首先依賴于代表性耐冷指標(biāo)和不同耐冷性材料的篩選。為了準(zhǔn)確反映不同棉花品種的萌發(fā)期耐冷性，普遍采用基于對(duì)照的低溫相對(duì)指標(biāo)[30]。本研究利用完成吸脹的露白種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，它們?cè)诔叵?4 h內(nèi)均可以正常萌發(fā)。因此利用露白種子進(jìn)行低溫萌發(fā)試驗(yàn)可以消除材料本身其他因素的影響，從而直接反映出低溫下不同材料的萌發(fā)期耐冷性。前人研究中，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、萌發(fā)指數(shù)等常作為鑒定萌發(fā)性強(qiáng)弱的指標(biāo)[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，綜合指標(biāo)除與這些指標(biāo)極顯著正相關(guān)外，與低溫萌發(fā)后胚芽鮮干重呈極顯著正相關(guān)，與平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽速度呈極顯著負(fù)相關(guān)，這些指標(biāo)在前人的研究中還鮮見報(bào)道。這說明胚芽鮮干重可以與其他常見萌發(fā)指標(biāo)一起作為耐冷鑒定的正向指標(biāo)，而平均發(fā)芽時(shí)間和平均發(fā)芽速度可以作為萌發(fā)期耐冷鑒定的負(fù)向指標(biāo)。

3.2 棉花萌發(fā)期與吸脹期耐冷性的比較

棉花的不同材料在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的耐冷性往往存在差異，說明棉花在不同生育階段應(yīng)對(duì)低溫脅迫的機(jī)制不同。棉花春播后經(jīng)常面臨突發(fā)的低溫天氣，這對(duì)種子吸脹和萌發(fā)都會(huì)產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠顯著降低種子的相對(duì)吸水量和吸水速度；低溫吸脹速率與低溫相對(duì)吸脹速率呈極顯著正相關(guān)（R=0.58，P＜0.001），說明低溫下的吸脹速率能夠部分地反映種子吸脹階段的耐冷性。低溫吸脹速率和低溫相對(duì)吸脹速率作為吸脹階段的2個(gè)耐冷鑒定指標(biāo)與萌發(fā)期的耐冷鑒定指標(biāo)間不相關(guān)或呈較弱的負(fù)相關(guān)性，這可能是由于吸脹階段的耐冷性和萌發(fā)階段的耐冷性調(diào)控機(jī)制不同所致。王俊娟等[30]發(fā)現(xiàn)棉花萌發(fā)期和芽期的耐冷性存在差異，芽期比萌發(fā)期對(duì)低溫冷害更敏感。黃賀等研究發(fā)現(xiàn)，不同甘藍(lán)型油菜萌發(fā)期耐冷性與成苗期耐冷性不相關(guān)[35]。HUANG等[10]發(fā)現(xiàn)玉米不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)部的指標(biāo)間相關(guān)性較強(qiáng)，而不同發(fā)育時(shí)期間耐冷指標(biāo)的相關(guān)性不顯著。在本研究中，即便是萌發(fā)期，早期的吸脹階段與萌發(fā)期其他指標(biāo)也呈現(xiàn)出不相關(guān)或較弱的相關(guān)性，而萌發(fā)期指標(biāo)與芽期的有關(guān)指標(biāo)（比如胚、芽鮮干重）則呈顯著相關(guān)，這些都暗示著棉花萌發(fā)期耐冷性的復(fù)雜性。

3.3 低溫冷害對(duì)棉花萌發(fā)期種子生理生化的影響

在低溫脅迫下，植物在遭受傷害時(shí)其內(nèi)部發(fā)生一系列變化，比如活性氧產(chǎn)生速度加快、膜脂氧化加速、可溶性蛋白含量積累等等，而植物體內(nèi)會(huì)通過形成SOD、POD、CAT等抗氧化酶來降低脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的傷害。本研究表明，在4℃低溫處理12 h時(shí)，SOD、POD和CAT酶活性在耐冷材料中達(dá)到最低，脅迫后24 h時(shí)酶活性又上升到接近對(duì)照；冷敏感材料中的酶活性在脅迫后均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在脅迫24 h時(shí)顯著地低于耐冷性材料，超氧化物歧化酶基因與過氧化物酶基因的表達(dá)量變化與酶活性變化的趨勢(shì)基本一致，說明SOD和POD酶活性與其在低溫誘導(dǎo)下的基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性較高，耐冷材料的抗氧化能力比冷敏感材料更強(qiáng)。王冀川等[36]通過研究低溫冷害對(duì)海島棉幼苗生理生化特性的影響發(fā)現(xiàn)，SOD和POD是清除棉花體內(nèi)活性氧以減輕膜脂傷害的重要保護(hù)酶類，這與耐冷材料中SOD和POD的酶活性與其相關(guān)基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照及冷敏感材料的結(jié)果相一致。兩材料中可溶性蛋白濃度均高于對(duì)照，且在耐冷材料中的濃度顯著高于冷敏感材料，說明可溶性蛋白濃度與棉花種子萌發(fā)期耐冷性相關(guān)。姜艷麗等也有類似的研究報(bào)道，可溶性蛋白能夠降低植物細(xì)胞因冷害而受傷致死的機(jī)會(huì)，從而提高植物的抗寒性[3]。綜上所述，在低溫脅迫下新陸中4號(hào)比中103026能夠更有效地清除活性氧，其可溶性蛋白濃度相對(duì)也更高，抗氧化能力更強(qiáng)，擁有較高的耐低溫萌發(fā)性，是研究棉花萌發(fā)期耐冷性的重要候選材料。

3.4 棉花萌發(fā)期耐冷性鑒定及品種耐冷性比較

通過對(duì)種子萌發(fā)期耐冷性綜合評(píng)價(jià)值進(jìn)行聚類分析，將53份棉花供試材料分為強(qiáng)耐冷、耐冷、不耐冷和冷敏感4個(gè)類型。其中，新陸中4號(hào)耐冷性最強(qiáng)而中103026耐冷性最差。在本研究中，新陸中14號(hào)萌發(fā)期種子不耐冷，其親本中棉所19在苗期抗冷性較差[37]，表明新陸中14號(hào)可能在發(fā)育的早期（萌發(fā)幼苗期）表現(xiàn)出不耐冷性。貝爾諾斯的2個(gè)衍生品種，新陸中19和新陸早 31分別在萌發(fā)期和幼苗期同時(shí)表現(xiàn)出不耐冷特性[38]，這暗示貝爾諾斯可能具有不耐冷的遺傳背景，而其耐冷性有待進(jìn)一步研究。邯559屬于萌發(fā)期不耐冷型，而其親本邯鄲109表現(xiàn)子葉期抗冷性[30]；石早 1號(hào)的萌發(fā)期種子不耐冷，其親本雙價(jià)抗蟲棉SGK321據(jù)報(bào)道在幼苗期抗冷性較強(qiáng)[39]，這可能是育種導(dǎo)致耐冷信息丟失或生育時(shí)期不同所致。在耐冷品種中，新陸早 60與李星星等[40]在萌發(fā)期鑒定的耐冷性結(jié)果一致，說明該品種具有穩(wěn)定的萌發(fā)期耐冷性。根據(jù)綜合指標(biāo)可以看到，新陸中4號(hào)、新陸中32號(hào)、新陸中9號(hào)、新陸中6號(hào)為萌發(fā)期強(qiáng)耐冷品種，新陸中20號(hào)、新陸中60號(hào)為萌發(fā)期耐冷品種，以上6個(gè)品種的早熟性綜合指標(biāo)值均較小（相對(duì)早熟性較差）。而姜艷麗等[3]通過對(duì)6個(gè)不同熟性的陸地棉品種幼苗進(jìn)行4℃處理，發(fā)現(xiàn)早熟品種中50和N52的耐冷性最強(qiáng)；尹曉斐[41]通過進(jìn)一步分析這6個(gè)品種二葉期幼苗4℃脅迫下的超氧化物歧化酶基因（CSD2a）表達(dá)量，得出與之前相同的結(jié)論。本研究表明處理溫度的不同和時(shí)期的差異可能是導(dǎo)致以上結(jié)果存在出入的主要原因。這也說明，棉花的耐冷性是受多種因素（溫度、遺傳背景、生育時(shí)期等）共同影響的，單一因素的改變可能導(dǎo)致耐冷鑒定結(jié)果出現(xiàn)顯著差異。

4 結(jié)論

低溫冷害能夠顯著降低棉花種子萌發(fā)期吸脹階段的相對(duì)吸水量和吸水速率，且材料之間存在差異。活力指數(shù)、萌發(fā)后芽干重、萌發(fā)后芽鮮重、平均發(fā)芽時(shí)間及平均發(fā)芽速度五項(xiàng)指標(biāo)可作為陸地棉低溫萌發(fā)鑒定的主要指標(biāo)。品種新陸中 4號(hào)耐冷性最強(qiáng)，而中103026耐冷性最差，它們可以作為進(jìn)一步研究棉花萌發(fā)期耐冷性機(jī)制的材料。POD酶活力、SOD酶活力、CAT酶活力和可溶性蛋白濃度可作為棉花萌發(fā)期抗冷鑒定的生理生化指標(biāo)。