畢秋艷, 黨志紅, 朱偉旗, 高占林?, 韓秀英?, 趙建江, 王文橋, 路粉, 吳杰

1河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000；2石家莊市農(nóng)林科學(xué)院趙縣實(shí)驗(yàn)基地，石家莊 051530

0 引言

【研究意義】大豆是全世界最重要的農(nóng)作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和社會(huì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2019年中國(guó)大豆播種面積933萬公頃（1.4億畝）。據(jù)農(nóng)情調(diào)查，2019年河北省大豆種植面積10.4萬公頃。河北省處于黃淮海夏大豆產(chǎn)區(qū)和北方春大豆產(chǎn)區(qū)交界地帶[1]，四季分明，光照充足，適宜大豆生產(chǎn)[2]。張家口、承德、唐山和秦皇島等地區(qū)為春大豆的主要產(chǎn)區(qū)[3]。其他地區(qū)以夏大豆為主，占整個(gè)河北省大豆種植面積的80%左右。隨著大豆種植面積的擴(kuò)大，病害成為影響其產(chǎn)量的主要因素之一。目前，我國(guó)已報(bào)道的大豆病害約40余種[4]，病原主要包括真菌、細(xì)菌、線蟲和病毒等，其中70%—80%為真菌病害，一般會(huì)造成10%—30%減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%以上，更嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致絕產(chǎn)[5]。大豆真菌病害不僅直接造成產(chǎn)量與品質(zhì)降低，部分病原真菌在侵染過程中還分泌多種對(duì)人畜有害的毒素與代謝物，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的安全性構(gòu)成極大威脅[6]。河北省作為全國(guó)的大豆主產(chǎn)區(qū)，及時(shí)科學(xué)診斷新病害并提出具體的防治藥劑，對(duì)于提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大豆真菌病害種類多、分布廣、危害大，各種病害從癥狀上難以區(qū)分，導(dǎo)致防治困難。常見的大豆病害包括大豆根腐病、菌核病、灰斑病、褐紋病、黑斑病、銹病、白粉病等[4]。隨著大豆種植面積的擴(kuò)大，自20世紀(jì)90年代，病害逐漸被認(rèn)為是大豆生產(chǎn)的限制因子[8]。大豆病害在不同地區(qū)的病原菌種類復(fù)雜，有些種的病原菌只在國(guó)外或中國(guó)真菌志上報(bào)道。大豆上同一種病害在不同國(guó)家、不同區(qū)域可能為同一屬不同種病原菌所致。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍均較為廣泛。該菌變異較多，種內(nèi)存在不同的生理小種[9]。對(duì)巴西進(jìn)境大豆進(jìn)行病害分離，參考Ainsworth分類系統(tǒng)鑒定出4種炭疽菌，證實(shí)了大豆炭疽菌具有多樣性。大豆灰斑病菌也具有非常明顯的生理分化現(xiàn)象[10]。阿根廷大豆曾被鑒定出主要病原菌分別為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、大雄疫霉大豆專化型（Phytophthora megasperma）、大豆猝死綜合癥病菌（Fusarium tucumaniae）、叉絲殼菌（Microsphaera diffusa）。巴西大豆曾被鑒定出主要病原菌有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）、平頭炭疽菌（Colletotrichum truncatum）和黑線炭疽菌（Colletotrichum dematium）[9]。從俄羅斯種植區(qū)采集的大豆植株的葉片和莖桿樣品中共分離到6種病原菌，分別為鏈格孢（Alternariasp.）、大豆北方莖潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorumvar.caulivora）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）、鐮孢菌（Fusariumsp.）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、毛霉（Mucor fragilis）[11]。對(duì)美國(guó)進(jìn)境大豆鑒定出主要病原菌包括細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、櫻桃鏈格孢（Alternaria cerasi）、苘麻鏈格孢（Alternaria abutilonis）、百日菊鏈格孢（Alternaria zinniae）、落葵鏈格孢（Alternaria basellae）[12]。阿根廷、巴西、俄羅斯和美國(guó)鑒定出的大豆主要病原菌可以在辣椒、雜草、小麥等植物上存在共生現(xiàn)象。在大豆病害化學(xué)防治方面，根腐病一般采用 50%多菌靈可濕性粉劑+50%福美雙可濕性粉劑（3﹕2），用藥總量為種子重的0.5%進(jìn)行拌種防治[7]。由于藥劑拌種只能控制前期根部病害，成株期一旦發(fā)病應(yīng)盡早噴廣譜性殺菌劑防治。大豆灰斑病菌群體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致某些主栽品種在多雨年份時(shí)會(huì)大量發(fā)生灰斑病[10]。在灰斑病發(fā)病初期，應(yīng)及時(shí)噴灑1—2次殺菌劑減輕發(fā)病。70%甲基硫菌靈可濕性粉劑1 000倍液或 75%百菌清可濕性粉劑 700—800倍液對(duì)灰斑病具有抑制作用[13]。在大豆疫病發(fā)病初期，60%氟嗎啉·代森錳鋅可濕性粉劑1 500倍或50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 500倍噴霧對(duì)其具有抑制作用[14]。腐霉利、菌核凈、三唑酮和苯醚甲環(huán)唑等對(duì)大豆白粉病和菌核病均有很好的防治效果[15]。大豆銹病的防治藥劑有三唑酮、萎銹靈、多菌靈和代森錳鋅等[16]。此外，大豆炭疽病防治藥劑以苯醚甲環(huán)唑或百菌清為主；大豆紫斑病、黑斑病、灰星病、莖枯病防治藥劑均以多菌靈或代森錳鋅為主[15]。綜上，大豆病害的防治使用比較頻繁的殺菌劑以多菌靈、甲基硫菌靈、福美雙、菌核凈、腐霉利、三唑酮、萎銹靈、百菌清、退菌特、烯酰嗎啉和代森錳鋅老品種為主，偶見苯醚甲環(huán)唑、氟嗎啉·代森錳鋅藥劑的使用。【本研究切入點(diǎn)】近年河北省大豆新增幾種不常見病害[6,15]，由于對(duì)其病害及病原菌種類不十分了解[17]，導(dǎo)致藥劑種類的選用比較困難?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)河北省主要大豆真菌病害和病原菌種類進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并針對(duì)所鑒定病害和病原菌展開不同種類殺菌劑的篩選，為河北省大豆真菌病害的有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2019年在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 病樣的采集與病原菌分離、保存

筆者課題組于2019年5—9月自河北省大豆主產(chǎn)區(qū)采集具有不同典型、明顯病癥的地上部大豆葉片、夾和莖稈，帶回實(shí)驗(yàn)室，用清水將其沖洗并晾干，在病健交界處剪取長(zhǎng)5 mm、寬2—3 mm的長(zhǎng)方形標(biāo)本組織，用0.1%升汞溶液消毒5 min，再用無菌水漂洗3次，直接移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基平板上。每個(gè)培養(yǎng)皿中接種3—5塊標(biāo)本組織，置于溫度25℃、相對(duì)濕度70%、黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后選取每種病原菌形態(tài)一致的菌落進(jìn)行反復(fù)純化，挑取邊緣菌絲再接于PDA平板上，于相同條件下培養(yǎng)7—10 d，待產(chǎn)孢后挑取單孢進(jìn)行培養(yǎng)3—7 d，獲得純培養(yǎng)菌株。單孢菌株接種到常規(guī)PDA培養(yǎng)斜面上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑、儀器、殺菌劑及培養(yǎng)基

Fungal DNA Kit D3390試劑盒，Omega Bio-Tek公司；PCR擴(kuò)增試劑盒、2×Taq PCR Mix、DNA Marker DL2000，日本TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；正置BX63顯微鏡，日本Olympus公司；超景深三維VHX-1000立體顯微鏡，KEYENCE基恩士（中國(guó)）有限公司；Thermo NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)，美國(guó)NanoDrop科技有限責(zé)任公司；SimpliAmpTMThermal Cycler PCR儀，美國(guó)Life technologies公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

殺菌劑：95%苯醚甲環(huán)唑原藥（利爾化學(xué)股份有限公司）；99.5%氟菌唑原藥（江蘇禾本生化有限公司）；95%葉菌唑原藥（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）；98%肟菌酯原藥（山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司）；95%嘧菌酯原藥（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）；97.5%吡唑醚菌酯原藥（浙江禾本科技有限公司）；95%氰烯菌酯原藥（江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司）；96%氟吡菌酰胺原藥（拜耳股份公司）；96%啶酰菌胺原藥（安徽廣信農(nóng)化股份有限公司）；99.4%辛菌胺原藥（陜西省西安嘉科農(nóng)化有限公司）；95%乙蒜素原藥（南陽(yáng)神圣農(nóng)化科技有限公司）。制劑：10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；30%氟菌唑可濕性粉劑（日本曹達(dá)株式會(huì)社）；60 g·L-1葉菌唑水乳劑（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）；50%肟菌酯懸浮劑（青島奧迪斯生物科技有限）；250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司）；250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油（巴斯夫歐洲公司）；25%氰烯菌酯懸浮劑（江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司）；41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（拜耳股份公司）；50%啶酰菌胺水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司）；1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（陜西省蒲城美爾果農(nóng)化有限公司）；80%乙蒜素乳油（南陽(yáng)神圣農(nóng)化科技有限公司）。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至 1 L；不加瓊脂為馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）液體培養(yǎng)基。AEA培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、NaNO36g、KH2PO41.5 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、丙三醇20 mL、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L；YBA培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、蛋白胨5 g、醋酸鈉20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 河北省大豆主要真菌病害病癥及病原菌分離純化 觀察不同植株病害病癥（A—E），記錄病斑顏色、發(fā)病程度、發(fā)病規(guī)律等，將典型病癥照相并帶回實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定及回接致病性驗(yàn)證 菌落特征觀察：將純化后的病原菌菌株分別接種于PDA平板上，置于25℃、黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)5 d，進(jìn)行菌落特征的觀察和拍照，記錄菌落形態(tài)、顏色。

菌絲、孢子形態(tài)觀察：對(duì)純化菌株平板培養(yǎng) 5 d后在超景深三維VHX-1000立體顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、顏色，之后繼續(xù)平板培養(yǎng)至10—15 d后產(chǎn)孢；對(duì)平板上不能產(chǎn)孢的病原菌A，將其于PDA平板上培養(yǎng)5 d后在菌株邊緣打孔，取其直徑5 mm菌柄至30 mL PD培養(yǎng)液進(jìn)行搖床160 r/min振動(dòng)培養(yǎng)7 d至產(chǎn)孢；正置BX63顯微鏡下觀察孢子的形態(tài)、顏色及結(jié)構(gòu)特征等，并進(jìn)行顯微形態(tài)觀測(cè)、拍照，參照有關(guān)資料進(jìn)行鑒定。

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后，對(duì)于不能很好使葉片致病的 A、B病原菌，在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5 d后，用滅菌牙簽蘸取打孔直徑菌落2 mm，與豆莖稈成45°針刺植株第一莖節(jié)，刺穿后旋轉(zhuǎn)牙簽，并緩慢抽出[18]。其他病原菌回接致病性驗(yàn)證，選取室內(nèi)無菌培養(yǎng)的健康大豆葉片噴霧接種病原菌孢子懸浮液，每片葉子噴濃度為1×103個(gè)/mL的孢子懸浮液0.5 mL。待接種發(fā)病后，觀察致病力，并從病部再分離病原菌，比較所分離病原菌與原接種病原菌是否一致。

1.3.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 病原菌菌株在PDA培養(yǎng)基25℃黑暗培養(yǎng)7 d后，用滅菌手術(shù)刀刮取培養(yǎng)基表面菌絲 50—200 mg置于離心管中，采用Fungal DNA Kit D3390試劑盒抽提病原菌基因組DNA，于超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度，其余的DNA溶液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。真菌物種鑒定使用 rDNA-ITS 作為 Marker片段，使用ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC通用引物擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Ex Taq buffer 2.0 μL，5 U Ex Taq 0.2 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 1.6 μL，引物 ITS1 1 μL，引物 ITS4 1 μL，DNA 0.5 μL，ddH2O 13.7 μL，總體積20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，25 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120 V電壓電泳30 min PCR擴(kuò)增結(jié)果，觀察圖像是否有特異性目的片段。將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司。用各基因相對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行3730XL一代雙末端測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果質(zhì)控與組裝、拼接。將所得序列校對(duì)后于 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，然后用MEGA 7.0軟件根據(jù)各菌株 rDNA-ITS基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用 NJ法（neighbor-joining method）構(gòu)建分子進(jìn)化樹，并進(jìn)行1 000次自展抽值檢驗(yàn)分子進(jìn)化樹可靠性。分析病原菌菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)菌株的親緣關(guān)系，進(jìn)行近源物種信息的確認(rèn)。同時(shí)，將1.3.2室內(nèi)接種的致病力菌株分離鑒定，rDNA-ITS序列檢測(cè)其與原接種病原菌序列是否一致。根據(jù)1.3.1、1.3.2和1.3.3初步分析的病原菌種類結(jié)果，對(duì)已有特異性引物的病原菌進(jìn)行特異性保守序列分子驗(yàn)證鑒定。使用特異性引物TEF1-αF：ATGGGTAAGG ARGACAAGAC 和 TEF1-αR：GGARGTACCAGTSAT CATGTT對(duì)病原菌A[19]、ACT-512F：ATGTGCAAGGC CGGTTTCGC和ACT-783R：TACGAGTCCTTCTGGC CCAT對(duì)病原菌B[20]、EF-1F：CATCGAGAAGTTCG AGAAGG和EF-1R：TACTTGAAGGAACCCTTACC對(duì)病原菌D[21]進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、反應(yīng)程序條件、電泳、測(cè)序、分子進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析同上。

1.4 河北省大豆主要真菌病害防治藥劑篩選

1.4.1 室內(nèi)殺菌劑的毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定5種不同種類殺菌劑的11個(gè)代表品種對(duì)河北省大豆主要病原菌的抑制作用。

供試原藥分別用適量丙酮溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1的母液，加入無菌水進(jìn)行系列稀釋，通過預(yù)試驗(yàn)得到供試藥劑對(duì)不同病原菌的有效濃度范圍。苯醚甲環(huán)唑和氟菌唑?yàn)?3、1.5、0.75、0.375、0.1875、0.0938、0.0469、0.0234 μg·mL-1；葉菌唑?yàn)?1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.1563、0.0078 μg·mL-1；肟菌酯和嘧菌酯為 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7813 μg·mL-1；吡唑醚菌酯為 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563 μg·mL-1；氰烯菌酯和氟吡菌酰胺為200、50、12.5、3.125、0.7813、0.1953、0.0488、0.0122、0.0061 μg·mL-1；啶酰菌胺為800、200、50、12.5、3.125、0.7813、0.1953 μg·mL-1；辛菌胺為 80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg·mL-1；乙蒜素為 600、300、150、75、37.5、18.75、9.375、4.6875 μg·mL-1。酰胺類殺菌劑（氟吡菌酰胺、啶酰菌胺）用YBA含藥平板[22]，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（肟菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、氰烯菌酯）用 AEA+水楊肟酸（100 μg·mL-1）含藥平板[23]，其他藥劑用 PDA 含藥平板，同時(shí)設(shè)置丙酮和空白對(duì)照。將分離鑒定好的木賊鐮孢（Fusarium equiseti）、大豆炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）、莖點(diǎn)霉菌（Phoma herbarum）、鏈格孢（Alternaria alternata）、嘴突凸臍蠕孢（Exserohilum rostratum）分別接種于PDA平板上，用直徑5 mm打孔器在預(yù)培養(yǎng)5 d的各大豆病原菌菌落邊緣打取菌餅，正面朝下分別接種到各含藥和空白對(duì)照平板上。每處理重復(fù)4次，置于25℃、相對(duì)濕度70%、黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，對(duì)照組病原真菌菌落接近長(zhǎng)滿平板，采用十字交叉法分別測(cè)量各處理的菌落直徑。計(jì)算各處理濃度的抑制率[22-23]，抑制率（%）＝100×（對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-處理菌落增長(zhǎng)直徑）／對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑。

1.4.2 殺菌劑在離體葉片或幼莖上對(duì)大豆主要病害的防治效果 不同種類殺菌劑代表品種按照其使用說明的推薦劑量分別設(shè)置處理濃度：30 μg·mL-1苯醚甲環(huán)唑、75 μg·mL-1氟菌唑、6 μg·mL-1葉菌唑、150 μg·mL-1肟菌酯、150 μg·mL-1吡唑醚菌酯、50 μg·mL-1嘧菌酯、60 μg·mL-1氰烯菌酯、50 μg·mL-1氟吡菌酰胺、500 μg·mL-1啶酰菌胺、12 μg·mL-1辛菌胺、100 μg·mL-1乙蒜素。預(yù)試驗(yàn)后對(duì)于不能很好使葉片致病A、B病原菌，選擇大豆健康幼苗采取針刺莖節(jié)接種病原菌的方法。大豆第一片真葉平展后針刺第一莖節(jié)接種。將病原菌在PDA 培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5 d后，用滅菌牙簽蘸取打孔直徑菌落2 mm，與豆莖稈成 45°針刺植株第一莖節(jié)[18]，刺穿后旋轉(zhuǎn)牙簽，并緩慢抽出，以未蘸取菌落的滅菌牙簽針刺植株作為對(duì)照。接種后植株置于25℃、相對(duì)濕度95%—100%培養(yǎng)室保濕48 h，再用壓力0.1 MPa的空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器將不同濃度殺菌劑均勻噴施到供試植株上，每株噴施1 mL藥液。所有殺菌劑處理各重復(fù)5次，空白對(duì)照噴蒸餾水，試驗(yàn)重復(fù)4次。之后 25℃，相對(duì)濕度 75%—100%繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后調(diào)查發(fā)病情況并計(jì)算各殺菌劑對(duì)病害的防治效果。

殺菌劑在離體葉片上對(duì)其他大豆主要病害的影響：選擇健康的大豆葉片，每?jī)善~子背面朝上置于直徑15 cm培養(yǎng)皿中的濾紙上，每皿加15 mL蒸餾水保濕，用濕潤(rùn)的脫脂棉包裹葉柄。將病原菌培養(yǎng)至產(chǎn)孢，每皿葉子噴濃度為1×103個(gè)/mL的孢子懸浮液0.5 mL；于25℃下恒溫培養(yǎng)1 d后，用壓力0.1 MPa的空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器將不同濃度殺菌劑均勻噴施到供試葉片上，以霧滴均勻欲滴而不落為度，每皿葉子1 mL藥液。所有殺菌劑處理各重復(fù)5皿，空白對(duì)照噴蒸餾水，試驗(yàn)重復(fù)4次，所有處理于25℃恒溫光照培養(yǎng)，7 d后調(diào)查發(fā)病情況并計(jì)算各殺菌劑對(duì)病害的防治效果。

（4）使用種次號(hào)能實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)編目。編目系統(tǒng)可自動(dòng)查重而生成新的種次號(hào)，實(shí)現(xiàn)種次號(hào)的自動(dòng)取號(hào)，提高編目效率。

病害分級(jí)調(diào)查參照大豆根部病害和葉部病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)進(jìn)行[24]。0級(jí)：無病斑；1級(jí)：病斑面積占植株/葉片總面積1/4以下；2級(jí)：病斑面積占植株/葉片總面積1/4—1/2；3級(jí)：病斑面積占植株/葉片總面積1/2以上；4級(jí)：病斑連片，但沒有壞死；5級(jí)：植株/葉片萎蔫或枯死。計(jì)算公式：病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病株/葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總株/葉數(shù)×5）×100；防治效果（%）=100×（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel和SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行不同殺菌劑對(duì)同種病害防治效果的差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 大豆主要真菌病害癥狀

病害A：初期莖基部表皮出現(xiàn)淡紅褐色不規(guī)則病斑，病斑逐漸變成灰褐色凹陷壞死，并繞根莖擴(kuò)展，地上部植株矮小瘦弱，葉色淡綠，后期分枝、結(jié)莢干枯，形成灰黑色壞死斑（圖1-A-1），癥狀似土傳病害。

病害B：大豆莢部病斑為圓形，褐至淺灰色（圖1-B-1），嚴(yán)重時(shí)小黑點(diǎn)呈輪紋狀排列，病莢無種子或皺縮、干癟，癥狀似炭疽病。

病害C：發(fā)病初期葉片出現(xiàn)黃褐色稍凹陷斑點(diǎn)，病斑逐漸擴(kuò)大，凹陷加深，邊緣變褐色，病斑邊界清晰（圖 1-C-1），后期多個(gè)病斑融合成不規(guī)則大斑，癥狀似葉斑病的一種。

病害D：葉片發(fā)病初期圓形至不規(guī)則形病斑，中央褐色，四周略隆起，有時(shí)呈暗褐色輪紋狀，后期病斑擴(kuò)展或破裂，葉片卷曲干枯（圖 1-D-1），濕度大時(shí)表面有密集黑色霉層，癥狀也似葉斑病的一種。

2.2 大豆主要病原菌形態(tài)學(xué)及回接致病性驗(yàn)證

病原菌A：在PDA培養(yǎng)基上，菌落形狀圓形，米白色至淡黃色，氣生菌絲較短，棉絮狀，不能長(zhǎng)至培養(yǎng)皿蓋（圖1-A-3、1-A-4）。孢子形態(tài)：大型分生孢子似月牙形，3—6個(gè)分隔，分隔明顯，頂孢呈錐形（圖1-A-5）。通過形態(tài)特征觀察該菌被初步鑒定為鐮孢菌的一種。病原菌回接驗(yàn)證結(jié)果表明，該病原菌具有致病力（圖 1-A-2）。室內(nèi)回接病原菌致病組織進(jìn)行再分離，獲得的病原菌形態(tài)特征與原接種菌株一致。

病原菌B：在PDA培養(yǎng)基上，菌落圓形，氣生菌絲氈狀或絨狀，緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，菌落邊緣整齊，呈灰白色，培養(yǎng)3 d后菌絲開始變黑（圖1-B-3、1-B-4）。培養(yǎng)3 d后開始產(chǎn)生厚垣孢子，厚垣孢子單生或串生于菌絲頂端或中間，褐色至黑褐色，光滑。分生孢子單胞，無色，新月形或鐮刀狀，一端尖銳，另一端較鈍，無附著胞產(chǎn)生（圖 1-B-5）。通過形態(tài)特征觀察該菌被初步鑒定為大豆炭疽菌的一種。病原菌回接驗(yàn)證結(jié)果表明，該病原菌具有致病力（圖 1-B-2）。室內(nèi)回接病原菌致病組織進(jìn)行再分離，獲得的病原菌形態(tài)特征與原接種菌株一致。

病原菌C：在PDA培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)呈近圓形，有輪紋，邊緣不均勻，菌落中央稍隆起，菌絲灰白色，生長(zhǎng)旺盛，棉絮狀（圖 1-C-3、1-C-4）。分生孢子器呈橢圓形至圓形，黑褐色；分生孢子呈卵圓形或橢圓形，無色單胞（圖1-C-5）。觀察其形態(tài)特征與莖點(diǎn)霉描述相符。病原菌回接驗(yàn)證結(jié)果表明，該病原菌具有致病力（圖1-C-2）。室內(nèi)回接病原菌致病組織進(jìn)行再分離，獲得的病原菌形態(tài)特征與原接種菌株一致。

病原菌D：在PDA培養(yǎng)基上，菌落簇生，褐色或青褐色（圖1-D-3、1-D-4）。分生孢子梗單生或數(shù)根束生，暗褐色；分生孢子倒棒形（圖 1-D-5），3—6個(gè)串生，有縱隔膜1—2個(gè)，橫隔3—4個(gè)，橫隔處偶有縊縮現(xiàn)象。通過形態(tài)特征觀察該菌被初步鑒定為鏈格孢的一種。病原菌回接驗(yàn)證結(jié)果表明，該病原菌具有致病力（圖 1-D-2）。室內(nèi)回接病原菌致病組織進(jìn)行再分離，獲得的病原菌形態(tài)特征與原接種菌株一致。

病原菌E：在PDA培養(yǎng)基上，菌落灰褐色，中央隆起，棉絮狀，邊緣氣生菌絲絨毛狀，背面褐色（圖1-E-3、1-E-4）。分生孢子梗單生或簇生于菌絲，褐色，光滑，多隔膜。分生孢子淡褐色至中等褐色，橢圓形或近圓柱形，端部鈍圓，基部有明顯突出的臍點(diǎn)，常在兩端有隔膜增厚現(xiàn)象，中等褐色，兩端細(xì)胞顏色稍淺（圖1-E-5）。通過形態(tài)特征觀察該菌被初步鑒定為凸臍蠕孢的一種。病原菌回接驗(yàn)證結(jié)果表明，該病原菌具有致病力（圖1-E-2）。室內(nèi)回接病原菌致病組織進(jìn)行再分離，獲得的病原菌形態(tài)特征與原接種病原菌一致。

2.3 河北省大豆主要病原菌分子生物學(xué)鑒定及對(duì)應(yīng)病害種類確定

以ITS1和ITS4為引物，對(duì)田間分離出的5種病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均能擴(kuò)增出約600 bp的單一條帶，大小在500—750 bp（圖2-a）。用GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)和MEGA 7.0軟件的NJ法根據(jù)各菌株擴(kuò)增出的ITS分子序列進(jìn)行多重序列比較，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 3—圖 7）。根據(jù) LANDEWEERT等對(duì)真菌的分子分類鑒定原則[25]，即通過分子序列比對(duì)，序列相似性≥99%鑒定為相同種；序列相似性＞95%且＜99%，鑒定為相同屬；序列相似性≤95%，鑒定為相同科。病原菌A與木賊鐮孢LT617634.1相似性為100%，同時(shí)2.2分析該病原菌為鐮孢菌的一種，初步確定引起病害A的病原菌為木賊鐮孢；病原菌B與大豆炭疽菌MH290362.1相似性為100%，同時(shí)2.2分析該病原菌為大豆炭疽菌的一種，初步確定引起病害B的病原菌為大豆炭疽菌；病原菌C與莖點(diǎn)霉菌KJ767079.1相似性為100%，同時(shí)2.2分析該病原菌為莖點(diǎn)霉菌的一種，初步確定引起病害C的病原菌為莖點(diǎn)霉菌；病原菌 D與鏈格孢 KY951909.1相似性為100%，同時(shí)2.2分析該病原菌為鏈格孢的一種，初步確定引起病害D的病原菌為鏈格孢；病原菌E與嘴突凸臍蠕孢GQ169762.1相似性為100%，同時(shí)2.2分析該病原菌為凸臍蠕孢的一種，初步確定引起病害E的病原菌為嘴突凸臍蠕孢。利用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)分離的5種室內(nèi)回接致病菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定結(jié)果與原病原菌一致（圖2-b）。

同時(shí)，以特異性引物TEF1-αF和TEF-1αR對(duì)病原菌A、ACT-512F和ACT-783R對(duì)病原菌B、EF-1F和EF-1R對(duì)病原菌D進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果也均能擴(kuò)增出約600 bp的單一條帶，大小在 500—750 bp（圖2-c）。用GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)和MEGA 7.0軟件的NJ法根據(jù)各菌株擴(kuò)增出的TEF1-α、ACT、EF-1α分子序列進(jìn)行多重序列比較，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8—圖10），病原菌A 與木賊鐮孢LT617634.1、病原菌B與大豆炭疽菌MH290362.1、病原菌D與鏈格孢KY951909.1仍分別聚類在一起。分子序列驗(yàn)證結(jié)果表明，病原菌A、B、D分別為木賊鐮孢、大豆炭疽菌、鏈格孢。

結(jié)合病害病癥、病原菌菌落形態(tài)、菌絲及孢子顯微形態(tài)和基于 ITS、TEF1-α序列系統(tǒng)發(fā)育分析，明確病害 A是由木賊鐮孢引起的大豆根腐病，病害 B是由大豆炭疽菌引起的炭疽病，D是由鏈格孢引起的大豆黑斑病。初步明確病害 C是由莖點(diǎn)霉菌引起的莖點(diǎn)霉葉斑病，病害E是由嘴突凸臍蠕孢引起的凸臍蠕孢葉斑病。

2.4 不同種類殺菌劑對(duì)5種病原菌的毒力

5種病原菌對(duì)三唑類殺菌劑敏感，苯醚甲環(huán)唑EC50值 0.0466—1.1102 μg·mL-1，氟菌唑 EC50值 0.0955—1.5024 μg·mL-1，葉菌唑 EC50值 0.0112—0.4206 μg·mL-1。5種病原菌對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯敏感，EC50值分別為 2.8012、0.1775、0.5791、9.3865 和 2.0022 μg·mL-1；僅木賊鐮孢對(duì)肟菌酯敏感，EC50值 1.8804 μg·mL-1；木賊鐮孢和大豆炭疽菌對(duì)氰烯菌酯敏感，EC50值分別為 0.0109和4.4280 μg·mL-1。大豆炭疽菌、莖點(diǎn)霉菌、鏈格孢、嘴突凸臍蠕孢對(duì)酰胺類氟吡菌酰胺敏感，EC50值2.5741—7.2185 μg·mL-1；大豆炭疽菌、莖點(diǎn)霉菌、嘴突凸臍蠕孢對(duì)啶酰菌胺敏感，EC50值 0.4857—2.5139 μg·mL-1。大豆炭疽菌和嘴突凸臍蠕孢對(duì)烷基多胺類殺菌劑辛菌胺敏感，EC50值分別為 8.4571 和 7.7361 μg·mL-1。大豆炭疽菌對(duì)有機(jī)硫仿生殺菌劑乙蒜素敏感，EC50值8.1840 μg·mL-1（表 1）。

表1 不同種類殺菌劑對(duì)分離自大豆的5種病原菌的毒力Table 1 Toxicity of different kinds of fungicide against 5 pathogens isolated from soybean

2.5 殺菌劑在離體葉片或幼莖上對(duì)大豆主要病害的防治效果

三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、氟菌唑、葉菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑肟菌酯、吡唑醚菌酯對(duì) 5種病害防治效果顯著，酰胺類殺菌劑氟吡菌酰胺對(duì)除大豆根腐病之外的其他4種病害防治效果顯著，酰胺類殺菌劑啶酰菌胺對(duì)莖點(diǎn)霉葉斑病防治效果顯著，烷基多胺類殺菌劑辛菌胺、有機(jī)硫仿生殺菌劑乙蒜素對(duì)炭疽病和凸臍蠕孢葉斑病防治效果顯著，其防治效果分別達(dá)到90%以上；其他殺菌劑對(duì)5種病害表現(xiàn)不同程度的防治作用，防治效果為55.41%—89.36%（表 2）。結(jié)合 2.4不同種類殺菌劑對(duì) 5種病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果，三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、氟菌唑、葉菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯推薦作為河北省大豆主要真菌病害的優(yōu)選兼治藥劑。

表2 不同種類殺菌劑在離體葉片或幼莖上對(duì)5種大豆真菌病害的防治效果Table 2 Control effects of different kinds of fungicide in vitro or young stems to 5 soybean fungal diseases

3 討論

不同病原菌侵染植物后其病癥存在不同程度的相似性，給病害診斷及病原菌鑒定帶來較大困難。本研究通過病原菌的宏觀形態(tài)、菌絲和孢子顯微結(jié)構(gòu)、ITS及特異性分子序列綜合分析，確定河北省大豆主產(chǎn)區(qū)的病原菌分別為木賊鐮孢、大豆炭疽菌、莖點(diǎn)霉菌、鏈格孢、嘴突凸臍蠕孢，對(duì)應(yīng)病害分別為大豆根腐病、炭疽病、莖點(diǎn)霉葉斑病、大豆黑斑病、凸臍蠕孢葉斑病。根部病害是危害豆類的重要病害之一，發(fā)生普遍，鐮孢菌是引起我國(guó)大豆根腐病的主要病原菌。鐮孢菌分多種，種群復(fù)雜，近年來常發(fā)生不同種鐮孢菌引起的大豆根腐病[26]，本研究發(fā)現(xiàn)引起河北省大豆根腐病的病原菌為木賊鐮孢。大豆炭疽病是世界各大豆產(chǎn)區(qū)重要病害之一，在烏拉圭大豆上曾發(fā)現(xiàn)類似炭疽病癥狀的豆稈，確認(rèn)其病原菌為大豆炭疽菌[27]。本研究中導(dǎo)致河北省大豆炭疽病的病原菌同樣為大豆炭疽菌。據(jù)中國(guó)真菌志記載莖點(diǎn)霉菌在雜草上曾有發(fā)生[28]，本研究在河北省大豆葉片上發(fā)現(xiàn)莖點(diǎn)霉菌。鏈格孢是一類適應(yīng)性強(qiáng)、極為常見的真菌。全世界已描述的近500個(gè)鏈格孢種級(jí)分類單位中，95%以上兼性寄生在植物上，引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害，如黑斑病、褐斑病、莖枯病、赤星病等。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于大豆中鏈格孢的研究較少。據(jù)報(bào)道，美國(guó)大豆分離出的鏈格孢屬于5個(gè)不同的種，同時(shí)也證實(shí)了大豆中鏈格孢菌的多樣性[12]，本研究鑒定出鏈格孢是引發(fā)河北省大豆黑斑病的病原菌。嘴突凸臍蠕孢在國(guó)外報(bào)道其廣泛寄生，寄主主要有稗屬、稻屬、小麥屬、各種雜草等[29]，據(jù)中國(guó)真菌志記載該病原菌也可侵染大豆，本研究發(fā)現(xiàn)凸臍蠕孢葉斑病由該病原菌引發(fā)。

河北省大豆真菌病害種類復(fù)雜，防治藥劑種類的科學(xué)選用成為有效防治大豆真菌病害的關(guān)鍵技術(shù)之一。生產(chǎn)上往往由于不了解病原菌種類和殺菌劑特性，盲目用藥，造成防治效果降低，同時(shí)影響環(huán)境[15]。因此，應(yīng)合理開展大豆病害科學(xué)、高效對(duì)靶藥劑防治。根據(jù)本研究中 5種殺菌劑 11個(gè)代表品種對(duì)河北省 5種大豆主要病原菌的抑制作用及對(duì)相應(yīng)病害的防治效果，推薦三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、氟菌唑、葉菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯作為河北省大豆主要真菌病害的優(yōu)選兼治藥劑。其田間防治效果有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

所選用殺菌劑的種類、作用機(jī)制與病原菌種類存在一定對(duì)應(yīng)關(guān)系。三唑類殺菌劑，其作用機(jī)理為影響甾醇類生物合成，使菌體細(xì)胞膜功能受到破壞[30]，對(duì)子囊菌亞門、擔(dān)子菌亞門和半知菌亞門的病原菌均有活性。本研究中木賊鐮孢和大豆炭疽菌無性時(shí)期屬于半知菌亞門，有性時(shí)期為子囊菌亞門；莖點(diǎn)霉菌屬于半知菌亞門；鏈格孢屬于子囊菌亞門；嘴突凸臍蠕孢屬于半知菌亞門。以上對(duì)應(yīng)關(guān)系也可以看出，三唑類甾醇抑制劑苯醚甲環(huán)唑、氟菌唑、葉菌唑可以作為河北省大豆主要真菌病害兼治的首選殺菌劑種類之一。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑通過抑制植物病原真菌中細(xì)胞色素bc1間的電子傳遞，從而抑制線粒體的呼吸作用，能有效防治子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌等引起的病害，其不同代表品種防治對(duì)象及抑制作用存在差異[31]。氰烯菌酯對(duì)半知菌亞門、子囊菌亞門的鐮孢菌屬真菌病害有顯著的防治效果。肟菌酯對(duì)子囊菌亞門白粉病、半知菌亞門葉斑病有特效。嘧菌酯高效、廣譜，對(duì)幾乎所有真菌界的子囊菌亞門、擔(dān)子菌亞門、鞭毛菌亞門和半知菌亞門等病害均有良好的活性，但由于該殺菌劑生產(chǎn)上使用普遍，存在抗藥性水平上升、防治效果下降的現(xiàn)象[32]。吡唑醚菌酯防治子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌綱引起的多種病害，同時(shí)它又是一種新型殺菌劑，能誘導(dǎo)許多作物的生理變化，增強(qiáng)硝酸鹽（硝化）還原酶的活性提高對(duì)氮的吸收，降低乙烯的生物合成，延緩作物衰老，促進(jìn)作物的生長(zhǎng)?？梢?，甲氧基丙烯酸酯類呼吸抑制劑吡唑醚菌酯也可作為河北省大豆主要真菌病害兼治的首選殺菌劑之一。

由于氣候變化等多種因素的作用，病害的發(fā)生逐漸呈現(xiàn)出種類多、頻率高的趨勢(shì)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害日益增強(qiáng)。大豆真菌病害與溫度、濕度及降雨、耕作制度等變化關(guān)系密切，因此，隨著各種條件的不斷變化，應(yīng)及時(shí)調(diào)查和鑒定田間病害和病原菌種類的發(fā)生、發(fā)展程度，根據(jù)病害的種類合理選用殺菌劑，達(dá)到有效防治的目的。

4 結(jié)論

河北省大豆主產(chǎn)區(qū)致病病原菌分別為木賊鐮孢、大豆炭疽菌、莖點(diǎn)霉菌、鏈格孢、嘴突凸臍蠕孢，對(duì)應(yīng)病害分別為大豆根腐病、炭疽病、莖點(diǎn)霉葉斑病、大豆黑斑病、凸臍蠕孢葉斑病。推薦三唑類甾醇抑制劑、甲氧基丙烯酸酯類呼吸抑制劑吡唑醚菌酯作為河北省大豆主要真菌病害綜合防治的優(yōu)選兼治藥劑。