喬德才 李許貞 劉曉莉 胡琰茹

北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動學(xué)院（北京 100875）

本實(shí)驗(yàn)室從2001年開始關(guān)注紋狀體對運(yùn)動性疲勞（exercise-induced fatigue）的中樞調(diào)控作用及其機(jī)制的研究，通過采用玻璃微電極細(xì)胞外電生理記錄技術(shù)，麻醉狀態(tài)下在體觀察發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動疲勞大鼠紋狀體神經(jīng)元自發(fā)高頻放電比例增加，出現(xiàn)爆發(fā)式放電活動特征［1］，初步證實(shí)紋狀體神經(jīng)元參與了運(yùn)動疲勞的中樞調(diào)控，也是引起運(yùn)動疲勞的重要中樞腦區(qū)之一。但由于實(shí)驗(yàn)存在一定的滯后性，上述研究結(jié)果只能反映大鼠疲勞時神經(jīng)元電活動與安靜狀態(tài)的差異。事實(shí)上，大鼠在運(yùn)動過程中的行為能力具有明顯的階段性特征［2，3］，其行為能力改變主要受運(yùn)動中樞神經(jīng)元功能的控制與調(diào)節(jié)［4，5］。 為此，本研究采用金屬記錄電極手術(shù)植入技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對大鼠一次性力竭運(yùn)動過程中紋狀體神經(jīng)元電活動的實(shí)時、動態(tài)觀察，探討安靜、運(yùn)動、疲勞、恢復(fù)等不同狀態(tài)下紋狀體神經(jīng)元電活動變化特征與運(yùn)動能力的關(guān)系，為揭示紋狀體在運(yùn)動疲勞形成、恢復(fù)過程中的調(diào)控規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性 Wistar大鼠 12 只，體重（250±10）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2002-2003。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，自然光照，動物房內(nèi)溫度（20±3）℃，相對濕度為40%～60%。本實(shí)驗(yàn)在北京師范大學(xué)運(yùn)動生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 金屬電極植入手術(shù)

實(shí)驗(yàn)前將大鼠用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，俯臥固定于腦立體定位儀（SN-3N，日本成茂）上，沿大鼠頭頂正中線做一矢狀位切口，暴露前、后囟及冠、矢狀縫等骨性標(biāo)志，調(diào)整門齒高度，使前囟和后囟處在同一水平面上。依照大鼠腦立體定位圖譜［6］，在紋狀體對應(yīng)的顱骨部位鉆孔，掀去硬腦膜，將金屬電極植入左側(cè)紋狀體（P：0.2，L：3，H：3.2），并用小螺釘和牙科水泥固定，保證電極不隨動物的活動而移動或松動。注射地塞米松注射液緩解術(shù)后腦水腫。大鼠恢復(fù)4～5天，手術(shù)引起的不良反應(yīng)即可消失，飲食和行為活動恢復(fù)正常，開始進(jìn)行恢復(fù)性遞增負(fù)荷運(yùn)動訓(xùn)練，并使大鼠逐漸適應(yīng)測試系統(tǒng)導(dǎo)聯(lián)狀態(tài)下的跑臺運(yùn)動。待大鼠能以20 m/min的速度跑30 min，并未見不良反應(yīng)，即可進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.3 大鼠力竭運(yùn)動方案

力竭運(yùn)動采用本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)Bedford方法修改建立的遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動方案［7］。運(yùn)動前，先將大鼠置于動物跑臺 （DSPT-202，杭州段氏）上安靜30 min，隨后進(jìn)行跑臺運(yùn)動。負(fù)荷分三級：I級負(fù)荷：8.2 m/min，15 min；II級負(fù)荷：15 m/min，15 min；III級負(fù)荷：20 m/min，運(yùn)動至力竭。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠跑姿由蹬地式變?yōu)榉厥?，滯留在跑道末端不能繼續(xù)跑動，且聲波和光刺激均不能驅(qū)使動物繼續(xù)維持跑動。

1.4 大鼠力竭運(yùn)動過程中LFPs信號采集

大鼠開始運(yùn)動之前，金屬電極經(jīng)導(dǎo)聯(lián)線與主放大器（Dagan EX4-400，美國）連接，導(dǎo)聯(lián)線由柔細(xì)屏蔽線組成，以盡量減少工頻干擾對信號的影響。導(dǎo)聯(lián)線靠近電極端包含一個JFET前置放大器（headstage），該前置放大器由一塊TL082（Texas Instrument，美國）集成電路制成，用于消除運(yùn)動過程中由于導(dǎo)線運(yùn)動、纏結(jié)造成的信號偽跡。信號采集由多通道記錄儀 （PowerLab 8/30，AD Instrument澳大利亞）及自身所帶軟件Chart5完成，采樣頻率512 Hz，50 Hz數(shù)字陷波，主放大器硬件濾波設(shè)置為0.1～100 Hz，增益200。連續(xù)動態(tài)記錄大鼠安靜、運(yùn)動、力竭和恢復(fù)期紋狀體神經(jīng)元局部場電位 （local field potentials，LFPs）的電信號（圖1），并對大鼠運(yùn)動能力進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)完成后，取腦組織制作常規(guī)冰凍切片，并進(jìn)行Nissl染色，對照大鼠腦立體定位圖譜鑒定金屬電極尖端所在位置（圖2），金屬電極未準(zhǔn)確插入紋狀體的數(shù)據(jù)將被刪除。

圖1 力竭運(yùn)動過程中紋狀體LFPs動態(tài)記錄模式圖

圖2 紋狀體局部電極尖端定位腦片圖

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用 Chart5 及 NeuroExplorer4（Plexon，美國）離線分析軟件，快速傅立葉轉(zhuǎn)換 （Fast Fourier Transform，F(xiàn)FT）welch 法（FFT size為 512），對原始 LFPs信號進(jìn)行各種參數(shù)的統(tǒng)計(jì)與分析。從力竭運(yùn)動過程中每一階段選取4個30s的原始信號進(jìn)行頻率譜分析。根據(jù)腦電活動特征劃分的方法，將LFPs劃分為5個頻段 （δ 波：0.8～3.9 Hz，θ 波：4～7.9 Hz，α 波：8～12.9 Hz，β 波：13～30 Hz 及 γ 波：30 Hz以上）［8］， 分別計(jì)算不同頻段的功率譜密度值（power spectrum density，PSD）。力竭運(yùn)動過程中每15min取4個30s LFPs電信號進(jìn)行功率譜重心頻率（gravity frequency，fg）的計(jì)算， 其中：fg為重心頻率；f1到 f2為頻率范圍；P（f）為信號的功率譜；f為頻率值［5］，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果

2.1 力竭運(yùn)動過程不同階段劃分及大鼠運(yùn)動能力觀察

12只大鼠中，實(shí)際記錄到有效信號的8只，其余大鼠均不納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。運(yùn)動能力觀察發(fā)現(xiàn)：運(yùn)動開始后，大鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷自主運(yùn)動；持續(xù)一段時間后，大鼠的自主運(yùn)動能力明顯下降；此時給予聲、光、電等外部輕微刺激后，大鼠仍可維持原有速度繼續(xù)運(yùn)動直至力竭。由于不同大鼠運(yùn)動至力竭的時間個體差異較大（163.7±29.32）min，為便于觀察大鼠在不同運(yùn)動狀態(tài)LFPs的動態(tài)變化規(guī)律，根據(jù)大鼠行為特征將整個運(yùn)動過程劃分為以下6個階段：A：安靜狀態(tài)；B：自主運(yùn)動狀態(tài)（0～30 min，大鼠在自我驅(qū)動下能夠維持預(yù)定強(qiáng)度運(yùn)動）；C：疲勞運(yùn)動狀態(tài)（力竭前60 min～力竭，通過輕度驅(qū)趕刺激大鼠能夠維持預(yù)定強(qiáng)度運(yùn)動）；D：力竭狀態(tài)（通過驅(qū)趕刺激也無法維持預(yù)定強(qiáng)度運(yùn)動）；E：恢復(fù)30 min（力竭后恢復(fù)30 min）；F：力竭后恢復(fù) 90 min（力竭后恢復(fù) 90 min）。忽略自主運(yùn)動狀態(tài)與疲勞運(yùn)動狀態(tài)之間的時間點(diǎn)，以保證檢測樣本統(tǒng)計(jì)處理的一致性。不同狀態(tài)下LFPs原始波形如圖3所示。

2.2 力竭運(yùn)動過程中紋狀體LFPs頻率譜特征變化

力竭運(yùn)動過程中紋狀體LFPs頻率譜變化特征如圖4所示。從圖4中可以看出，安靜狀態(tài)下大鼠紋狀體LFPs放電振幅較高，自主運(yùn)動狀態(tài)下放電幅度明顯降低（圖4-A）；安靜、力竭和恢復(fù)30 min紋狀體LFPs頻率譜有明顯差異，力竭狀態(tài)放電幅度明顯低于安靜狀態(tài)和恢復(fù)期（圖4-B）。

2.3 力竭運(yùn)動過程中紋狀體LFPs功率譜特征變化

力竭運(yùn)動過程中紋狀體LFPs功率譜變化特征如圖5所示。從圖5中可以看出，大鼠紋狀體LFP功率譜分布在運(yùn)動狀態(tài)與非運(yùn)動狀態(tài)有明顯差異，主要表現(xiàn)在運(yùn)動狀態(tài)總功率出現(xiàn)多峰值，特別是疲勞運(yùn)動狀態(tài)；在安靜、自主運(yùn)動、力竭及其后的恢復(fù)期內(nèi)，大鼠紋狀體LFP放電頻率主要集中在<10Hz范圍內(nèi)，以慢波δ和θ波為主；而疲勞運(yùn)動狀態(tài)下大鼠紋狀體LFP放電頻率主要集中在<15Hz范圍內(nèi)，α波增多。

以安靜狀態(tài)下各頻段的PSD值為基值，求其它階段各頻段與安靜狀態(tài)的比值，并對比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以消除不同大鼠個體差異帶來的影響（圖6）。從圖6可以看出，與安靜狀態(tài)相比，自主運(yùn)動和疲勞運(yùn)動狀態(tài)紋狀體LFPs各波段PSD顯著升高 （P<0.05，P<0.01）；力竭時各波段PSD明顯下降至安靜水平；恢復(fù)30 min和90 min，δ波、θ波、α波PSD仍顯著高于安靜狀態(tài)（P<0.05），而β波、γ波PSD則均未出現(xiàn)顯著變化（P>0.05）。

2.4 力竭運(yùn)動過程中大鼠紋狀體LFPs功率譜重心頻率的變化曲線

力竭運(yùn)動過程中大鼠紋狀體LFPs功率譜重心頻率的變化，結(jié)果如圖7所示。從圖7中可以看出，運(yùn)動開始后，fg持續(xù)顯著升高 （P<0.05，P<0.01），力竭前15 min升至最高點(diǎn)，隨后fg持續(xù)下降，力竭后恢復(fù)30 min時fg降至最低點(diǎn)，之后雖略有回升，但與安靜水平相比無顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

基底神經(jīng)節(jié)與運(yùn)動控制有密切聯(lián)系［9］。通過直接通路（皮層―紋狀體―蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部―丘腦―皮層）、間接通路（皮層―紋狀體―蒼白球外側(cè)部―丘腦底核―蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部―丘腦―皮層）和超直接通路（皮層―丘腦底核―蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部―丘腦―皮層）與皮層運(yùn)動區(qū)發(fā)生聯(lián)系［10，11］。直接通路可對運(yùn)動皮層產(chǎn)生興奮作用，間接和超直接通路可對運(yùn)動皮層產(chǎn)生抑制作用。紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)中信息傳導(dǎo)的主要核團(tuán)之一，它接受來自皮層的大量神經(jīng)投射，直接或間接參與隨意運(yùn)動的程序編制與執(zhí)行。同時，在調(diào)節(jié)運(yùn)動方向、順序、速度、幅度以及運(yùn)動可塑性等方面都具有重要作用［12］。目前，對紋狀體神經(jīng)元活動機(jī)制的研究主要采用電生理學(xué)研究方法，它可以在不傷及組織的條件下觀察神經(jīng)元活動的瞬間變化。記錄LFPs是神經(jīng)電生理學(xué)研究的重要手段之一，主要分析指標(biāo)有放電頻率及頻率譜、功率譜密度及功率譜重心頻率等。低頻、高幅的神經(jīng)元放電活動一般代表中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性降低，抑制性增強(qiáng)；而高頻、低幅則反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增強(qiáng)，抑制性減弱。功率譜重心頻率曲線不僅可以較好地反映功率譜密度的分布情況，還反映不同條件下整個功率譜的遷移情況，它與腦功能狀態(tài)存在非常密切的關(guān)系［8］。清醒安靜時，正常腦電的高、低頻放電功率相對平衡；腦疲勞時，皮層抑制程度增加，腦電高頻成分減少，低頻成分增加，整個功率譜重心頻率向低頻遷移，反之，則向高頻遷移。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動過程中，大鼠紋狀體神經(jīng)元LFPs活動的動態(tài)變化特征主要表現(xiàn)為：安靜狀態(tài)下放電頻率較低、幅度較高；運(yùn)動過程中放電頻率逐漸升高、幅度逐漸降低；力竭后逐漸恢復(fù)至安靜時水平。功率譜重心頻率動態(tài)變化規(guī)律為：運(yùn)動開始，紋狀體LFPs活動的功率譜重心頻率由低頻向高頻逐漸遷移，力竭前達(dá)到峰值，隨后逐漸向低頻遷移，力竭后及恢復(fù)初期降至最低點(diǎn)。由此可以認(rèn)為：當(dāng)紋狀體接受來自大腦皮層的運(yùn)動指令后，通過直接通路向皮層發(fā)放興奮性沖動，以發(fā)起動作并維持預(yù)定的運(yùn)動強(qiáng)度；當(dāng)運(yùn)動時間持久并出現(xiàn)疲勞時，紋狀體通過間接通路向皮層發(fā)放抑制性沖動，使皮層興奮性減弱，導(dǎo)致運(yùn)動能力降低。紋狀體在力竭運(yùn)動的不同階段可分別通過直接通路和間接通路對運(yùn)動行為能力進(jìn)行調(diào)節(jié)。

神經(jīng)元間的信息傳遞主要依賴神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)現(xiàn)［12］。紋狀體可接受來自皮層的谷氨酸（Glu）能興奮性神經(jīng)纖維投射，再發(fā)出γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)纖維，經(jīng)直接或間接通路到達(dá)蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部，經(jīng)丘腦返回皮層［13］。本實(shí)驗(yàn)室前期采用微透析和高效液相色譜聯(lián)用等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大鼠一次性力竭運(yùn)動過程中在自主運(yùn)動期，紋狀體內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu的作用占優(yōu)勢，神經(jīng)元以興奮性功能活動為主，通過激活直接通路，釋放更多的GABA抑制蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部的活動，對丘腦GABA能神經(jīng)元去抑制，對運(yùn)動起興奮作用；而在疲勞運(yùn)動期和力竭期，紋狀體內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA活動占優(yōu)勢，GABA能纖維主要通過間接通路，使丘腦底核Glu能神經(jīng)元去抑制，進(jìn)而引起蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部的興奮性增強(qiáng)，抑制丘腦Glu神經(jīng)元活動，最終對運(yùn)動起抑制作用［14，15］。 因此，可以推測，一次性力竭運(yùn)動過程中大鼠在自主運(yùn)動期紋狀體主要是以Glu能神經(jīng)元功能活動占優(yōu)勢，而在運(yùn)動疲勞后期至力竭期，則是以GABA能神經(jīng)元的功能活動占優(yōu)勢。

4 總結(jié)

一次性力竭運(yùn)動過程中大鼠紋狀體神經(jīng)元LFPs活動呈現(xiàn)動態(tài)變化規(guī)律，主要表現(xiàn)為：與安靜狀態(tài)相比，運(yùn)動過程中放電頻率逐漸升高、幅度逐漸降低，力竭后逐漸降低至安靜水平。紋狀體LFPs電活動的改變與運(yùn)動疲勞有關(guān)?？梢哉J(rèn)為，在運(yùn)動初期紋狀體主要是通過直接通路參與皮層運(yùn)動的調(diào)控，而在運(yùn)動后期，則主要通過間接通路發(fā)揮作用。提示：兩條通路的平衡失調(diào)是導(dǎo)致大鼠運(yùn)動能力下降的重要原因之一。

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