胡英，孫寶瑩，高珊

（1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江寧波3 1 5 1 0 0；2.濟(jì)南市中心醫(yī)院神內(nèi)科，濟(jì)南2 5 0 0 1 3）

槲皮素包合物微球的制備及其體外釋放研究Δ

胡英1＊，孫寶瑩2，高珊1

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波3 1 5 1 0 0；2.濟(jì)南市中心醫(yī)院神內(nèi)科，濟(jì)南2 5 0 0 1 3）

目的：制備槲皮素β-環(huán)糊精包合物-殼聚糖微球（QT-CD-CM），并考察其理化性質(zhì)和藥物體外釋放性能。方法：采用有機(jī)溶劑揮發(fā)法制備槲皮素β-環(huán)糊精包合物，再用乳化分散-離子交聯(lián)法、以三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑制備殼聚糖微球，并考察其形態(tài)、粒徑、包封率、載藥量和體外釋放情況。結(jié)果：制備的QT-CD-CM形態(tài)規(guī)則、均質(zhì)、無粘連，平均粒徑（3.3 2 7±0.1 2 4）μm，包封率為3 2.4%，載藥量為1 2.3%，在5%乙醇-磷酸鹽緩沖液介質(zhì)中7 2h可以達(dá)到完全釋藥，釋藥過程符合一級動力學(xué)模型。結(jié)論：QT-CD-CM理化性質(zhì)及體外釋藥性能良好，制備工藝簡單，有望成為理想的槲皮素給藥系統(tǒng)。

槲皮素；包合物；殼聚糖；微球；制備；體外釋放

槲皮素（Quercetin，QT）及其衍生物是自然界分布最廣的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗菌、抗病毒、抗癌等多方面的藥理作用[1]。由于QT不溶于水，且油水分配系數(shù)小，難以通過胃腸道黏膜吸收，故生物利用度低，至今尚無一種較有效的制劑應(yīng)用于臨床。將難溶性的藥物包合后可增加其溶解度[2]，從而提高溶出度和生物利用度，降低刺激性和不良反應(yīng)[3]，其中β-環(huán)糊精（β-CYD）是良好的天然包合材料。以微球作為微粒給藥系統(tǒng)的研究已相對深入，但主要涉及水溶性藥物控釋或緩釋方面，由于難溶性藥物存在釋藥不完全的問題，對其研究相對較少。

本試驗將難溶性藥物QT先形成包合物，再在此基礎(chǔ)上制成微球，并研究該包合物微球的理化性能及體外釋藥行為。其中，選擇殼聚糖（CS）作為微球材料，因其是一種天然、可生物降解的高分子陽離子聚合物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性[4]，已被廣泛應(yīng)用作微球材料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3 0 0 0型高效液相色譜（HPLC）儀（美國戴安公司）；CRY-2 P差熱分析儀（上海天平儀器廠）；XL3 0掃描電鏡（荷蘭Philips公司）；XSZ-3顯微鏡（北京市科儀電光儀器廠）；Zetasizer Nano激光衍射粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；AL2 0 4型電子天平（梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司）。

1.2 試藥

QT原料藥（山西慧科植物開發(fā)有限公司，批號：1 0 1 1 1 8，純度：＞9 8%）；QT對照品（美國Sigma公司，批號：1 1 3 k1 0 5 1，純度：＞9 9%）；CS（玉環(huán)海洋生化有限公司，分子量：8 0 0 0 0，去乙酰度：8 5%）；β-CYD（上海源聚生物科技有限公司，批號：1 0 0 6 2 1）；甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

透析袋（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，分子量：1萬～1.4萬）。

2 方法與結(jié)果

2.1 QT包合物（QT-CD）的制備

采用有機(jī)溶劑揮發(fā)法[5]。稱取約0.5 6 8 5 g的β-CYD溶于1 0 mL水中達(dá)到飽和，再加入用適量乙醇溶解的約0.1 8 g QT，有機(jī)溶劑揮發(fā)后，在6 0℃下，磁力攪拌4 h，即得。

2.2 空白微球（CM）的制備

采用乳化分散-離子交聯(lián)法制備微球[6]。取CS（2%）-醋酸（2%）溶液9 mL，以水-油比1∶3（V/V）量取混合溶液，加至體積分?jǐn)?shù)為1%吐溫8 0和4%司盤8 0的液體石蠟2 7 mL中，室溫下攪拌0.5 h，得到W/O型乳液。按照NH2-多聚磷酸鈉（TPP）＝1.5∶1（摩爾比）的比例，滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的TPP溶液6 mL，繼續(xù)攪拌1.5h。依次用適量的石油醚、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、丙酮洗滌，抽濾，真空干燥，備用。

2.3 載藥QT微球（QT-CM）的制備

按照QT-CS＝1∶1（質(zhì)量比）的藥載比先將約0.1 8 g QT用乙醇溶解后，再加入到CS（2%）-醋酸（2%）溶液9 mL中，攪拌1 5 min，靜置得到QT-CS混合溶液，再采用“2.2”項下方法制備微球。

2.4 載藥QT包合物微球（QT-CD-CM）的制備

按照QT-CS＝1∶1（質(zhì)量比）的藥載比將QT-CD加入到CS（2%）-醋酸（2%）溶液9 mL中，攪拌1 5 min，靜置得到QT-CDCS混合溶液，再采用“2.2”項下方法制備微球。

2.5 微球載藥量和包封率的測定[6]

稱取微球適量，在研缽中研碎，用適量無水乙醇浸泡，超聲1 h，3 7℃恒溫振蕩2 4 h，取上清液用適量5 0%乙醇稀釋使QT完全溶出，離心后經(jīng)0.4 5μm濾膜過濾得澄清的溶液，用HPLC法在3 7 3 nm波長測定其峰面積（A），代入“2.7.3”項下回歸方程計算出濃度（c），求得QT的含量及包封率：載藥量＝（微球內(nèi)藥物質(zhì)量/微球的總質(zhì)量）×1 0 0%；包封率（%）＝（系統(tǒng)中藥物總量－游離藥物量）/系統(tǒng)中藥物總量×1 0 0%。結(jié)果QT-CM、QT-CD-CM包封率分別為6.5%、3 2.4%，載藥量分別為9.3%、1 2.3%，后者明顯更高?？梢奞T形成包合物后增加了藥物的溶解度，易被包裹于CM中。

2.6 微球的形態(tài)及粒徑觀察

2.6.1 CM及QT-CD-CM的形態(tài)。用顯微鏡初步觀察2種微球的外觀形態(tài)，通過電鏡進(jìn)一步觀察其表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)。2種微球的形態(tài)圖見圖1。

圖1 2種微球的形態(tài)圖Fig 1 Morphology of 2kinds of microspheres

由圖1可見，顯微鏡下微球形態(tài)完整，表面光滑，呈類球形，粒子形狀較規(guī)則，大小較為均勻，無粘連。電鏡下微球表面呈一定的皺折狀，CM表面多孔且凹陷；QT-CD-CM表面孔略小，但凹陷更明顯。

2.6.2 3種微球的粒徑及分布。用激光衍射粒度分析儀測得CM、QT-CM、QT-CD-CM 3種微球的粒徑及分布情況，三者的粒徑分別為（3.2 1 4±0.0 5 6）、（3.2 9 6±0.1 1 8）、（3.3 2 7±0.1 2 4）μm，多分散指數(shù)（PDI）分別為0.1 3 2、0.1 4 1、0.1 9 2。

2.7 體外釋藥

2.7.1 QT的含量測定[2]。色譜條件：色譜柱為Hypersil BDSC18（2 5 0mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（PBS）（6 0∶4 0，PBS由4mL H3PO4+2mL三乙胺+1L的水組成），流速為1 mL·min－1，檢測波長為3 7 3 nm，進(jìn)樣量為1 0 μL，柱溫為3 0℃。理論板數(shù)按QT峰計不低于3 0 0 0。

2.7.2 溶液的制備。取QT對照品約1 7.5 mg，精密稱定，置于1 0 0 mL量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，得1 7 5 μg·mL－1的對照品溶液。精密稱取QT-CD-CM和QT-CM適量，置于1 0 0 mL量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液適量，用流動相分別制備成1 7 5 μg·mL－1的溶液作為供試品溶液。

2.7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[2]。精密吸取對照品溶液1、2、4、8、1 0 mL，分別置于2 5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，使成7、1 4、2 8、5 6、7 0 μg·mL－1的溶液。用0.4 5 μm濾膜過濾得澄清溶液，取樣分析，記錄色譜圖。以濃度（c）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得方程：A＝1.4 2 7 c+0.0 2 0（r＝0.9 9 9 9 8），表明QT檢測濃度線性范圍為7～7 0 μg·mL－1。

2.7.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率試驗。根據(jù)相關(guān)方法學(xué)要求進(jìn)行考察。（1）精密度試驗：對照品溶液連續(xù)測定6次的RSD＝0.1 3%。（2）重復(fù)性試驗：分別取3批QT-CM、QT-CDCM樣品，制備成供試品溶液各3份，結(jié)果QT-CM供試品中QT含量的RSD分別為1.1 2%、1.4 3%、2.1 1%，QT-CD-CM供試品中QT含量的RSD分別為2.1 2%、0.9 8%、1.6 7%。（3）穩(wěn)定性試驗：2種供試品室溫下放置，于1 2 h內(nèi)每隔2 h測定1次，結(jié)果QT-CM供試品中QT含量的RSD＝1.3 6%，QT-CD-CM供試品中QT含量的RSD＝2.1 0%。表明在測定條件下，QT在2種微球中1 2h內(nèi)均穩(wěn)定。（4）回收率試驗：精密稱取對應(yīng)處方量8 0%、1 0 0%、1 2 0%的QT對照品，分別加至QT-CM和QT-CDCM對應(yīng)處方量的輔料中，制得高、中、低濃度的回收率試驗溶液，分別測定3次。結(jié)果平均回收率分別為9 7.9%和9 9.1%，RSD分別為1.2 5%和2.1 7%。

2.7.5 載藥QT體外釋藥試驗。根據(jù)預(yù)試驗，分別精密稱取QT含量相同的QT-CM、QT-CD-CM適量，分別置于透析袋中，兩端緊扎。將其置于2 5mL釋放介質(zhì)（5%乙醇-PBS（pH＝5.3））中 ，每種樣品試驗3次，平行對照，將其置于（3 7±0.5）℃水浴振蕩器中，振蕩頻率為1 0 0次/min，于0.5、1、3、6、1 2、2 4、4 8、7 2、9 6、1 4 4、1 8 0 h時間點各取樣1 mL，同時補(bǔ)充同溫度的新鮮介質(zhì)1 mL。樣品經(jīng)0.4 5 μm濾膜過濾后，HPLC法測定，計算其累積釋放率，結(jié)果見圖2。

圖2 2種載藥微球的體外累積釋放曲線Fig 2 Drug release curves of 2kinds of drug-loaded microspheres in vitro

由圖2可見，QT-CD-CM釋放速度較快，在7 2 h左右就可以釋放完全。將累積釋放率與時間進(jìn)行線性回歸后[5]，得到QT-CD-CM的釋放速率為1.7 9 92h－1，而QT-CM的釋放速率為0.7 7 5 9 h－1，前者釋放速率明顯更快。

2.7.6 體外釋藥模型的擬合。采用常用藥物釋放模型即一級動力學(xué)方程、Higuchi方程、Weilbull方程對QT-CM、QT-CDCM釋藥數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見表1。

表1QT-CM、QT-CD-CM體外釋藥模型擬合結(jié)果Tab 1 Fitted drug release model of QT-CM and QT-CD-CM in vitro

由表1結(jié)果表明，QT-CM的體外釋藥更符合Weilbull動力學(xué)方程，QT-CD-CM體外釋藥更符合一級動力學(xué)方程。

3 討論

CS是一種氨基葡糖與N-乙酰葡糖胺的共聚物，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一的天然堿性多糖，具有良好的組織相容性和體內(nèi)降解性，故作為藥物載體有著極大的前景。但對于難溶性藥物，CS作為微球材料所得微球的載藥量和包封率均較低，但經(jīng)CYD包合后再形成微球可提高藥物的包封率和載藥量，從而改變藥物的釋放性能[5]。

微球的粒徑取決于CS溶液的濃度、乳劑的穩(wěn)定性、攪拌速度、固化劑的種類等，其中攪拌速度、表面活性劑用量對該微球粒徑的影響較大[7]。本試驗在微球制備過程中選擇表面活性劑占外相比為5%（1%吐溫8 0和4%司盤8 0），此時制備的微球外觀形態(tài)圓整，粒徑大小均勻，粒度分布范圍窄。

從本試驗結(jié)果可見，2種載藥微球（QT-CM、QT-CD-CM）的粒徑改變不大，但藥物的釋藥性能改變比較大，可以認(rèn)為難溶性藥物經(jīng)過包合作用后再制成微球，可以提高其釋藥性能，因此本文對槲皮素制劑的開發(fā)應(yīng)用具有一定的意義。

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Study on the Preparation of Quercetin Inclusion Complex Microsphere and Its Drug Release in Vitro

HU Ying，GAO Shan（Zhejiang Pharmaceutical College，Zhejiang Ningbo 3 1 5 1 0 0，China）
SUN Bao-ying（Dept.of Neurology，Jinan Central Hospital，Jinan 2 5 0 0 1 3，China）

OBJECTIVE：To prepare Quercetin-β-cyclodextrin inclusion complex-chitosan microspheres（QT-CD-CM），and to investigate their physiochemical property and release characteristics in vitro.METHODS：The quercetin-β-cyclodextrin inclusion complexes were prepared by organic solvent evaporation methods，and then formed chitosan microspheres which were prepared using emulsion-linking technique with sodium tripolyphosphate as the cross-linker.The morphology，particle size，encapsulation efficiency，drug-loading amount and release kinetics of microspheres were investigated.RESULTS：Prepared QT-CD-CM were regular，discrete and uniform spheres with mean particle size of（3.3 2 7±0.1 2 4）μm，encapsulation efficiency of 3 2.4%and drug-loading amount of 1 2.3%.Prepared microspheres released completely in 5%ethanol-PBS in 7 2h，which was in line with first-order kinetic model.CONCLUSION：QT-CD-CM are sound in physicochemical and release property and simple in preparation technology，and can be used as ideal drug delivery system for quercetin.

Quercetin；Inclusion complex；Chitosan；Microsphere；Preparation；In vitro release

R9 4 3

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）3 3-3 1 0 5-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.3 3.1 3

2 0 1 1-0 9-0 2

2 0 1 2-0 3-2 8）