肖衛(wèi)華陳佩杰 朱琳

1上海體育學院運動科學學院（上海200438）

2湘南學院體育系 3廣州體育學院運動與健康系

骨骼肌功能狀態(tài)是決定運動成績的關鍵因素之一，而骨骼肌炎癥水平是影響骨骼肌功能狀態(tài)的重要方面。骨骼肌細胞及骨骼肌中的免疫細胞可產(chǎn)生多種促炎因子和抑炎因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素 1β（IL-1β）、白介素 10（IL-10）、受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子（Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）等。 TNF-α 和 IL-1β 是典型的促炎因子，而IL-10是一種多功能、多細胞源性的抗炎細胞因子，在抑制炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。研究表明，大鼠以60%最大攝氧量強度進行8周有氧運動，可顯著降低骨骼肌中TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白含量[1]。離心運動則可引起骨骼肌中IL-1β蛋白含量升高，離心運動引起骨骼肌損傷可能與IL-1β積聚有關[2]。但過度訓練如何影響上述因子表達，仍不得而知。RANTES是一種典型的C-C亞族成員趨化性細胞因子，具有強大的誘導白細胞向炎癥部位浸潤的能力， 還能活化白細胞從而誘導炎癥[3]。RANTES表達水平增加與多種炎性疾病相關[4]，其表達水平升高是炎癥反應的特征之一[5]。但運動如何影響骨骼肌RANTES表達的研究較少，特別是過度訓練如何影響RANTES表達，未見相關報道。

除炎癥水平能影響骨骼肌功能狀態(tài)外，氧化應激水平也是影響骨骼肌功能的重要因素。NADPH氧化酶可介導產(chǎn)生活性氧（ROS），從而加劇組織的氧化應激水平，而gp91phox是NADPH氧化酶的關鍵催化亞基，因此 gp91phox 常被作為組織氧化狀態(tài)的指標[6，7]。運動特別是過度訓練如何影響骨骼肌gp91phox表達，仍不夠清楚。因此，本研究通過建立過度訓練模型，對過度訓練大鼠腓腸肌炎性因子及氧化應激相關基因表達水平進行了考察，為運動訓練特別是加深對過度訓練的認識提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

8周齡健康雄性Wistar大鼠26只，購于上海實驗動物中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，相對濕度50%～70%，每天光照時間為12 h，自由飲食。將大鼠隨機分為安靜對照組（C，n=10）、過度訓練后36 h取材組（E1，n=8）和過度訓練后 7天取材組（E2，n=8）。

1.2 過度訓練方案

適應性飼養(yǎng)1周后，過度運動組開始進行遞增負荷跑臺訓練（DSPT-202跑臺，中國杭州段氏制作公司），每周6次，周日休息，共訓練11周。過度訓練方案參考文獻方法[8，9]并略作修改（表1）。

1.3 取材

于訓練后相應時間點 （C組取材時間同E1組）斷頭處死大鼠，并分離右后肢腓腸肌，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄

在腓腸肌肌腹中點處剪取約60 mg組織，剪碎后加入1 ml Trizol（Invitrogen公司），用超聲波細胞粉碎機（JY92-Ⅱ，寧波新芝科器研究所）粉碎，靜置10分鐘后，加入200 μl氯仿并上下顛倒充分混勻，靜置5分鐘使明顯分層，12000轉(zhuǎn)，4℃離心15分鐘，小心吸取500 μl上清入一新離心管，加入等量異丙醇，顛倒混勻并靜置10分鐘，冷凍離心機（centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司）中12000轉(zhuǎn)，4℃離心10分鐘，白色沉淀即為RNA，用75%酒精洗滌2次后，加入30 μl DEPC水溶解。測OD值，OD260/280為 1.8～2.0的樣品可用，取 2 μg總 RNA，按 Fermentas公司第一鏈cDNA合成試劑盒說明，用梯度PCR儀（Mastercycler EP，德國 Eppendorf公司）進行反轉(zhuǎn)錄，20 μl體系。 合成的 cDNA 儲存在-20℃?zhèn)溆肹10]。

表1 大鼠過度訓練方案

1.5 熒光定量PCR

目的基因引物來自文獻[11，12]或由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成，β-actin做內(nèi)參基因，熒光定量引物見表2。使用定量PCR儀（Rotor-Gene 3000，Corbett Reseach） 進行擴增，SYBR Green試劑盒購自Fermentas公司。所有樣本擴增曲線正常，熔解曲線分析顯示呈銳而突出的單一產(chǎn)物峰。

1.6 統(tǒng)計學分析

CT 值用經(jīng)典的 2-△△CT法[13]處理后，用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件處理，單因素方差分析和皮爾遜相關分析，結果以平均值±標準差表示，統(tǒng)計學顯著性水平定為0.05。

表2 熒光定量PCR引物

2 結果

2.1 腓腸肌炎性因子基因表達

表3 腓腸肌炎癥相關基因表達相對C組變化倍數(shù)

表3顯示，C組、E1組和E2組三組間比較，促炎因子TNF-α和IL-1β mRNA表達量無顯著差異（P>0.05）；E1 組抑炎因子白介素 10（IL-10）mRNA表達量相對C組顯著降低 （P<0.05），E2組相對C組極顯著降低 （P<0.01），E1組和E2組間無差異；E1組和E2組趨化因子RANTES mRNA表達量相對C組顯著增加 （P<0.05），E1組和E2組間無差異。IL-10與RANTES呈直線負相關，相關系數(shù)r=-0.56（P<0.05）。

2.2 腓腸肌氧化應激基因表達

表4 腓腸肌氧化應激相關基因表達相對C組變化倍數(shù)

表4顯示，E1組和E2組NADPH氧化酶催化亞基gp91phox mRNA表達量相對C組有增加趨勢，但三組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與C組相比，E1組蛋白激酶C-δ（PKC-δ）mRNA表達量顯著增加（P<0.05），E2組 PKC-δ mRNA 表達量相對E1組降低，仍高于C組水平，但無統(tǒng)計學意義。

3 討論

因炎癥水平是影響骨骼肌功能狀態(tài)的重要因素，因此，本文對過度訓練時骨骼肌中炎性因子基因表達水平進行了考察。結果表明:過度訓練對大鼠腓腸肌促炎因子TNF-α和IL-1β表達無顯著影響，與安靜對照組相比，過度訓練后36 h組或恢復7天組TNF-α和IL-1β表達均無顯著變化；但過度訓練顯著抑制抑炎因子IL-10表達，與安靜對照組相比，運動后36 h組IL-10表達量顯著降低，恢復7天后并未恢復正常，而呈進一步下降趨勢（P<0.01）。此外，過度訓練顯著上調(diào)趨化因子RANTES表達，運動后36 h組和恢復7天組RANTES表達均顯著高于安靜對照組，約為安靜對照組的2倍。且IL-10與RANTES呈直線負相關，相關系數(shù)為-0.56（P<0.05）。上述結果表明，過度訓練使抑炎因子IL-10表達降低，使趨化因子RANTES表達顯著增加。即過度訓練使腓腸肌促炎因子和抑炎因子比例失衡，趨化因子表達增強，從而加劇腓腸肌炎癥反應，且停訓1周后這種炎癥狀態(tài)并無明顯改善。本研究結果與Hamada[14]的研究結果有所不同，他采用75%VO2max強度下坡跑，運動45分鐘，停止運動72 h后進行肌肉活檢，發(fā)現(xiàn)年輕組和老年組肌肉TNF-α表達量均顯著增加，而僅老年組肌肉IL-1β表達量顯著增加，年輕組無顯著變化。推測骨骼肌中炎性因子表達受運動強度、運動形式、運動時間、年齡等多種因素的影響。

除考察炎性因子表達外，本實驗還測定了骨骼肌氧化應激相關基因表達。NADPH氧化酶可介導ROS生成，從而在組織氧化應激中發(fā)揮作用。NADPH氧化酶由6個亞單位組成:胞膜亞單位（gp91phox、p22phox）和胞質(zhì)亞單位（p47phox、p40phox、p67phox及Rac蛋白）。靜息時上述成分處于解離狀態(tài)，沒有催化活性，受刺激后，p47phox發(fā)生磷酸化激活，募集其他胞質(zhì)成分一起轉(zhuǎn)位到胞膜，與胞膜亞單位結合組裝成有活性的NADPH氧化酶，從而發(fā)揮催化活性[15，16]。 最新研究表明，p47phox 的磷酸化受PKC-δ調(diào)控，PKC-δ是多種組織或細胞中NADPH 氧化酶活性的上游調(diào)控分子[7，17-19]。 本研究發(fā)現(xiàn)，雖然過度訓練對腓腸肌gp91phox表達無顯著影響，但調(diào)控其活性的信號分子PKC-δ在運動后36 h表達量顯著增加，它可使p47phox磷酸化激活，促使各亞基與gp91phox等組裝成有活性的NADPH氧化酶，從而介導超氧陰離子及過氧化物的生成，加劇組織氧化應激水平。

4 總結

過度訓練對大鼠骨骼肌TNF-α和IL-1β表達無顯著影響，但可顯著上調(diào)RANTES基因表達和下調(diào)IL-10基因表達；過度訓練可上調(diào)骨骼肌氧化應激相關基因表達。

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