劉 晶 王 雪 張佳寧 李 越 王校紅 于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030)

(黑龍江省糧食科研所2，哈爾濱 150030)

高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的研究

劉 晶1王 雪1張佳寧1李 越1王校紅2于殿宇1

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030)

(黑龍江省糧食科研所2，哈爾濱 150030)

研究了以醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜為載體的高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的固定化條件，采用響應(yīng)面分析法對(duì)固定化條件進(jìn)一步優(yōu)化，并對(duì)固定化酶膜的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了討論。結(jié)果表明，以固定化酶活力為指標(biāo)，當(dāng)高碘酸鈉濃度為0.15 mol/L，活化為60 min時(shí)，濃度為0.013 g/mL的酶液與pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液于戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.24%，溫度4℃下，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)3.1 h后，獲得的固定化酶活最高，為0.52 U/cm2。固定化酶膜的酶學(xué)性質(zhì)為:固定化酶最適溫度35℃，最適pH為9.0。

高碘酸鈉 醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜 脂肪酶 固定化

脂肪酶是一種廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中的酶，能夠進(jìn)行可逆的甘油酯鍵水解或合成。在一定的條件下，脂肪酶可以主要催化合成反應(yīng)，即可以用來合成生物柴油。無論在小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)還是工業(yè)規(guī)模的酯合成中，作為催化劑，脂肪酶已經(jīng)得到成功應(yīng)用［1－4］。固定化酶技術(shù)，就是將酶結(jié)合在載體上，或?qū)⑵湎拗圃谟邢蘅臻g內(nèi)的一類技術(shù)，酶仍能進(jìn)行相應(yīng)催化活性，并方便回收利用［5］。一般將酶的固定化技術(shù)分為酶與載體的結(jié)合和包埋兩大類。其中結(jié)合法包括物理吸附、離子吸附、共價(jià)鍵結(jié)合及交聯(lián)法等［6－9］。

固定化方法是否成功很大方面取決于選擇合適的載體。固定化載體的選擇主要考慮是否擁有固定化所需的最佳性能，如機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性、親水疏水性、孔隙度、反應(yīng)性、再生性及經(jīng)濟(jì)性等方面［10］。常用的載體主要有微晶纖維素、硅藻土、硅膠等。而以膜為載體，不僅結(jié)合了膜的分離功能，還結(jié)合了載體功能和分隔功能，具有其他載體不可比擬的優(yōu)點(diǎn)［11］。醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜具有一定的吸附性、化學(xué)穩(wěn)定性好、疏水性、機(jī)械性能優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)復(fù)合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應(yīng)體系中的活性和穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產(chǎn)品的生產(chǎn)。傳統(tǒng)的固定化方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，因此不能絕對(duì)說哪種方法優(yōu)于其他的方法，要針對(duì)固定化對(duì)象本身的特點(diǎn)和所要應(yīng)用的環(huán)境來選擇最適合的方法［12］。

本試驗(yàn)以醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜為載體，由于纖維素表面有大量的羥基，因此用高碘酸鈉氧化法來氧化活化載體膜，進(jìn)而更好的固定化脂肪酶，再以交聯(lián)的固定化方式，采用響應(yīng)面分析法確定了最佳的固定化條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脂肪酶:Sigma公司;聚丙烯，上海碩光電子科技有限公司;高碘酸鈉，氫硼化鈉:分析純，廣東東莞市大嶺山公司;磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉:天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;聚乙烯醇:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;橄欖油:中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑;其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

磁力攪拌器85－2型:江蘇中大儀器廠;LG10－2.4A型高速離心機(jī):北京市醫(yī)用離心機(jī)廠;電子天平:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜的制備

將5 g醋酸纖維素溶于100 mL丙酮中，待溶解完全成均一的膜液后，取試驗(yàn)前制備好的聚丙烯膜浸于溶有醋酸纖維素的丙酮溶液中，自然成膜，以去離子水沖洗醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜數(shù)次干燥備用［12］。

1.3.2 高碘酸鈉氧化法

取一張醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜懸浮于10 mL不同濃度的高碘酸鈉溶液中，室溫下置于搖床中搖動(dòng)一定時(shí)間，取出立即用去離子水洗至中性，吸干水分，與酶的磷酸鹽緩沖溶液于28℃進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)反應(yīng)后取出，懸浮于10 mL 1%氫硼化鈉溶液中于4℃反應(yīng)30 min，然后用0.1 mol的HAI溶液、2 mol的KCl溶液和水分別洗滌3次，取出測(cè)定酶活［13－14］。

1.3.3 脂肪酶活力測(cè)定(橄欖油乳化法)

將一定量的聚乙烯醇溶液和橄欖油按照一定的體積比(3∶1)混合，再用超聲波乳化成乳狀液。取4 mL乳化液和5 mL一定pH的緩沖液加入一定量的酶，預(yù)熱5 min后，同時(shí)在另一三角瓶中加入乳化液作空白樣，反應(yīng)15 min后，向兩瓶中加入15 mL 95%乙醇，終止反應(yīng)，用0.05 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，計(jì)算可得脂肪酶的分解活力。測(cè)定固定化酶酶活時(shí)將已固定化酶的濾紙剪碎，平均分成兩份，其中一份做空白［15－16］。

水解橄欖油每min產(chǎn)生1 μmol游離的脂肪酸定義為一個(gè)酶活力(U)。

式中:V為樣品所消耗堿的體積/mL;V0為空白樣品所消耗堿的體積/mL;t為反應(yīng)時(shí)間;n為稀釋倍數(shù);50為1 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉的微摩爾數(shù)。

固定化酶活定義為:每平方厘米固定化酶膜在37℃，pH 9.0的條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1 μmol的脂肪酸所消耗的酶量，用U/cm2表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化條件對(duì)固定化酶活的影響

2.1.1 不同高碘酸鈉濃度及活化時(shí)間對(duì)固定化酶活的影響

分別選取不同高碘酸鈉濃度和不同活化時(shí)間對(duì)固定化酶活進(jìn)行考察，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同高碘酸鈉濃度下活化時(shí)間對(duì)固定化酶活的影響

由圖1可知，當(dāng)NaIO4(高碘酸鈉)濃度為0.15 mol/L時(shí)，氧化時(shí)間為60 min時(shí)，所獲得的固定化酶的酶活最高，而隨著氧化的時(shí)間延長(zhǎng)，固定化酶的活力減弱。氧化程度通常由膜表面上的羥基被氧化成醛基的量來表示。由于醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜表面有大量的羥基，易于高碘酸鈉氧化羥基成醛基，利于下一步的交聯(lián)反應(yīng)。

2.1.2 交聯(lián)劑濃度對(duì)固定化酶活的影響

分別選取0.15% ～0.4%不同濃度的交聯(lián)劑(戊二醛)對(duì)固定化酶活進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2所示。

圖2 戊二醛濃度對(duì)固定化酶活的影響

由圖2可知，當(dāng)交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)固定化酶活力最大，當(dāng)交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.25%時(shí)，固定化酶活隨交聯(lián)劑濃度的增大而增加，而高于此值后固定化酶活力逐漸下降。

2.1.3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活的影響

交聯(lián)時(shí)間是一個(gè)需要嚴(yán)格控制的操作條件，試驗(yàn)選取1～6 h對(duì)交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果如圖3所示。

圖3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活的影響

由圖 3 可知，在交聯(lián)時(shí)間為 1、2、3、4、5、6 h 時(shí)，對(duì)酶的固定化效果分別進(jìn)行測(cè)定。在1 h時(shí)，酶活力還很低，只有0.42 U/cm2，說明大部分的酶還沒有被交聯(lián)上，繼續(xù)延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，2 h時(shí)活力上升為0.48 U/cm2，到3 h 時(shí)，酶活力最大，為 0.54 U/cm2，再繼續(xù)延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，酶活力開始下降，到5 h后，酶活力變化趨于穩(wěn)定，不再繼續(xù)下降。說明3 h為最佳交聯(lián)時(shí)間。

2.1.4 酶液濃度對(duì)固定化酶活的影響

在高碘酸鈉濃度為0.15 mol/L，氧化時(shí)間為60 min的條件下，氧化活化后的醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜懸浮于不同酶濃度的pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中交聯(lián)3 h，試驗(yàn)選取0.02～0.2 g/10 mL酶液濃度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶濃度對(duì)固定化酶活的影響

由圖4可知，當(dāng)酶的質(zhì)量濃度為0.015 g/mL時(shí)固定化效果最好。當(dāng)酶的質(zhì)量濃度低于0.015 g/mL時(shí)，固定化酶的酶活隨酶濃度的增大而增加，而高于此值固定化酶酶活不再增加。因此，確定酶液質(zhì)量濃度為 0.015 g/mL。

2.2 回歸方程的建立與分析

由單因素試驗(yàn)可以看出在脂肪酶的固定化過程中，交聯(lián)時(shí)間、交聯(lián)劑濃度、酶液濃度對(duì)固定化酶活力影響較大，而高碘酸鈉的濃度及活化時(shí)間主要是對(duì)酶膜上的羥基進(jìn)行氧化，對(duì)固定化的整個(gè)過程有影響，而要確定固定化條件主要是對(duì)交聯(lián)時(shí)間、交聯(lián)劑濃度及酶液濃度進(jìn)行優(yōu)化即可。因此，在交聯(lián)時(shí)間3 h，交聯(lián)劑濃度0.25%，酶液濃度0.15 g/10 mL基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計(jì)(Box － Benhnken)［17］，以交聯(lián)時(shí)間(A)、交聯(lián)劑濃度(B)和酶液濃度(C)為自變量，固定化酶活力(Y)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。自變量水平編碼見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3(P＜0.05為顯著項(xiàng))。

通過對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到酶活力(Y)對(duì)自變量交聯(lián)時(shí)間(A)、交聯(lián)劑濃度(B)和酶液質(zhì)量濃度(C)的回歸方程為:

Y=0.52+8.750E －003A －8.750E －003B －0.040C+2.500E － 003AC+2.500E － 003BC －0.033A2－0.038B2－0.041C2

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.000 1)失擬項(xiàng)不顯著(P ＞0.05)，并且該模型 R2=97.98%，=95.38%說明該模型與試驗(yàn)擬合良好。由表3還可以看出，脂肪酶的固定化過程中的 A、B、C、A2、B2和 C2為顯著影響因素。圖5為交聯(lián)時(shí)間與交聯(lián)劑濃度、交聯(lián)時(shí)間與酶液質(zhì)量濃度和交聯(lián)劑濃度與酶液質(zhì)量濃度的交互作用對(duì)酶活力的響應(yīng)曲面圖。

表3 方差分析結(jié)果

圖5 不同因素交互影響酶活力的等高線和響應(yīng)面圖

由圖5a可知，酶活力的極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在交聯(lián)時(shí)間為2.5～3.5 h，交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.25%時(shí)，酶活力在0.5 U/cm2以上。

由圖5b可知，酶活力的極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在酶液質(zhì)量濃度為0.13～0.18 g/10 mL，交聯(lián)時(shí)間約為3 h時(shí)，酶活力在0.5 U/cm2以上。

由圖5c可知，酶活力的極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.23% ～0.28%，酶液質(zhì)量濃度為0.15 g/10 mL時(shí)，酶活力在0.5 U/cm2以上。

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進(jìn)行試驗(yàn)，得到的酶活力為0.52 U/cm2。預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。表明所得出的回歸方程可以很好的反映交聯(lián)時(shí)間、交聯(lián)劑濃度和酶液濃度與酶活力的關(guān)系。因此響應(yīng)面分析法所得到的固定化條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，在實(shí)踐中具有可行性。

2.3 固定化酶最適溫度和pH穩(wěn)定性

2.3.1 固定化酶的最適溫度

在高碘酸鈉濃度為0.15 mol/L，氧化時(shí)間為60 min的條件下，氧化活化后的醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜懸浮于濃度為0.013 g/mL的酶液，在pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中交聯(lián)3.1 h，進(jìn)行固定化脂肪酶。將在上述條件下固定化的脂肪酶，分別在不同溫度條件下測(cè)定酶活并與游離酶作比較，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對(duì)固定化酶活及游離酶的影響

由圖6可知，固定化酶的最適溫度與游離酶接近，但是固定化酶活隨溫度變動(dòng)的幅度比游離酶小。以上結(jié)果說明，該固定化酶對(duì)溫度的敏感性更穩(wěn)定，不易失活。

2.3.2 固定化酶的最適pH

選擇不同的反應(yīng)pH，按上述測(cè)定固定化酶最適酶學(xué)性質(zhì)的步驟進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。

圖7 PH值對(duì)固定化酶活及游離酶的影響

由圖7可知，通過比較固定化酶和游離酶對(duì)pH的敏感性發(fā)現(xiàn)，固定化酶的最適pH為9.0，說明固定化酶受微環(huán)境的影響比游離酶小，且固定化后的脂肪酶的pH變化范圍不大。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了以醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜為載體的高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的固定化條件，基于高碘酸鈉的氧化活化作用下，酶分子能夠更好地與載體相交聯(lián)，并采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化固定化條件，通過試驗(yàn)確定了:當(dāng)高碘酸鈉濃度為0.15 mol/L，活化60 min，交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.24%，與質(zhì)量濃度為0.013 g/mL的酶和pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液交聯(lián)3.1 h后，獲得的固定化酶酶活最高，為0.52 U/cm2。采用響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)討論了固定化后的脂肪酶的pH及溫度穩(wěn)定性，結(jié)果是pH變化范圍不大，且對(duì)溫度的敏感性更穩(wěn)定，最適pH為9.0，最適溫度為35℃。

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Study on the Lipase Immobilization by Means of Sodium Periodate Oxidation

Liu Jing1Wang Xue1Zhang Jianing1Li Yue1Wang Xiaohong2Yu Dianyu1
(College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Harbin 150030)
(Hei Long Jiang Food Scientific Institute2，Harbin 150030)
(School of Food Science and Technology，Northeast Agricultural University3，Harbin 150030)

The lipase was immobilized on the acetylcellulose/polypropylene composite membrane by Sodium periodate oxidation and the response surface analysis was used to further optimize immobilized conditions，and then discussed the properties of immobilized enzyme membrane.The results indicated that the optimal conditions of the immobilized lipase are:with immobilized enzyme activities for index，the sodium periodate concentration was 0.15 mol/L，activated 60 min，which the lipase concentration was 0.013 g/mL with cross－linking agent concentration was 0.24%under the phosphate buffered solution of pH was 8.0，then after the time of adsorption － crosslinking for 3.1 h of temperature at 4 ℃，separately.The lipase activities were 0.52 U/cm2，and the optimal pH of the immobilized lipase was 9.0，the optimal operating temperature of the immobilized lipase was 35 ℃.

sodium periodate，acetylcellulose/polypropylene，lipase，lmmobilization

TS229

A

1003－0174(2012)04－0068－06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAD02B01)

2011－08－24

劉晶，女，1986出生，碩士，糧食油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，大豆油脂加工技術(shù)