肖 頔 王承明

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070)

水酶法提取油菜籽粕中多酚的研究

肖 頔 王承明

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070)

采用水酶法和響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)菜餅粕中多酚的提取工藝進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定pH、加酶量、溫度和反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素，通過響應(yīng)面分析得到了優(yōu)化組合條件。最佳工藝條件是:原料粒度80 目，液料比 25∶1，pH 5.0，加酶量4.3%，溫度 50 ℃，時(shí)間 43 min，此時(shí)菜籽多酚得率為 6.43 mg/g。

菜籽粕 多酚 提取 水酶法 響應(yīng)曲面法

油菜籽是世界三大油料作物之一。我國是世界上油菜籽產(chǎn)量最多的國家，近年來的年產(chǎn)量已達(dá)到1 000萬噸，提取菜籽油后，每年大約有650萬噸菜籽餅粕產(chǎn)生［1－3］。菜籽餅粕中蛋白質(zhì)含量很高，約為45%，但其中含有硫代葡萄糖苷、植酸、多酚化合物等有害及抗?fàn)I養(yǎng)成分，因而無法作為食品級(jí)蛋白質(zhì)，限制了菜籽餅粕的開發(fā)和利用［4］。大量的菜籽餅粕只能按少量比例添加到動(dòng)物飼料中或用作肥料，造成了資源的極大浪費(fèi)。從菜籽餅粕中把抗?fàn)I養(yǎng)成分提取出來，具有提高菜籽餅粕使用價(jià)值和增加其附加值的重要意義。

菜籽多酚是存在于菜籽餅粕中的一類植物次生代謝產(chǎn)物［5］。而且菜籽粕中多酚含量高于其他油料粕，大約是大豆粕30倍［6］。目前，從菜籽餅粕中提取菜籽多酚，國內(nèi)有關(guān)報(bào)道主要是采用甲醇、丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑提取，但由于環(huán)境污染和成本等原因，這些方法不太適合工業(yè)上的應(yīng)用。酶提取技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的提取技術(shù)，通過酶反應(yīng)溫和地將植物組織分解，可以加速有效成分的釋放和提取［7］。利用水酶法提取菜籽粕中多酚少有報(bào)道，本試驗(yàn)著重研究利用糖化酶提取菜籽餅粕中菜籽多酚的各個(gè)影響因素，并對(duì)其進(jìn)行了工藝優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜籽粕:由益海嘉里(武漢)糧油工業(yè)有限公司提供;糖化酶:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;一水合沒食子酸標(biāo)樣:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、磷酸、鹽酸、碳酸鈉和溴水為分析純。

1.2 主要儀器

電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;余佳水浴鍋:浙江省余姚市檢測儀表廠;pH計(jì):梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;722型分光光度計(jì):天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菜籽粕多酚含量的測定

采用 Folin－Ciolcallteu比色法［8］。

1.3.1.1 一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取一水合沒食子酸0.100 g，用蒸餾水溶解、定容至100 mL，此溶液質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。分別吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 到 100 mL 的瓶中，用水稀釋定容。即分別得到 0、10、20、30、40、50 μg/mL的一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

從 0、10、20、30、40、50 μg/mL 的一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別吸取1.0 mL，分別加水5 mL，F(xiàn)C顯色劑1.0 mL，7.5%碳酸鈉溶液3 mL，此時(shí)分別相當(dāng)于得到 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL 的一水合沒食子酸。放置2 h后在765 nm下測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度對(duì)沒食子酸濃度進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.3 含量測定

將油菜籽粕多酚提取液加蒸餾水定容至100 mL，準(zhǔn)確移取1.0 mL，按照“1.3.1.2”的方法處理樣品溶液，同樣測定A765，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到多酚含量。

1.3.2 工藝流程

油菜籽粕→粉碎→過篩→水酶法提取→離心取上清→定容至100 mL→FC測定

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

油菜籽粕機(jī)械粉碎后，過80目篩，準(zhǔn)確稱取一定量的經(jīng)過前處理的油菜籽粕，采用水酶法提取多酚，考察加酶量、反應(yīng)時(shí)間、液料比(水:菜籽粕，mL/g)、pH、溫度對(duì)多酚得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面的組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)［9］

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定pH(X1)、加酶量(X2)、溫度(X3)、反應(yīng)時(shí)間(X4)4個(gè)因素為自變量，多酚得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析及嶺嵴分析對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素及水平選取見表1。

表1 水酶法提取菜籽粕多酚試驗(yàn)的因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:y=0.126 8x+0.012 2，r=0.999 3。式中，x為反應(yīng)體系中沒食子酸含量(μg/mL)，y為反應(yīng)后反應(yīng)體系在765 nm下的吸光度。在0～5.0 μg/mL范圍內(nèi)，沒食子酸含量與A765呈極顯著性正相關(guān)。

2.2 水酶法提取菜籽多酚單因素試驗(yàn)

2.2.1 加酶量對(duì)多酚得率的影響

稱取1.00 g樣品，在液料比 15∶1，溫度為 50℃，pH 4.0 的條件下，分別加入 1%、2% 、3% 、4% 、5%、6%糖化酶，提取時(shí)間40 min，然后離心取上清液并定容，用FC比色法測定多酚含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 加酶量對(duì)多酚得率的影響

從圖1中可以看出，隨著糖化酶用量的增加，多酚得率逐漸提高，酶用量達(dá)一定值后，多酚得率增加緩慢。這可能是由于底物中與酶相互作用的位點(diǎn)飽和，趨近于穩(wěn)定，綜合考慮，選擇4%加酶量較合適。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

稱取1.00 g樣品，在液料比15∶1，溫度為50℃，pH 4.0，加酶量4%的條件下，提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

由圖2可知，在一定的范圍內(nèi)隨著提取時(shí)間的延長，得率得到提高，但在40 min后得率反而有所降低。其原因可能是在長時(shí)間高溫下菜籽多酚發(fā)生氧化、降解、縮合等反應(yīng)，使得得率降低。因此提取時(shí)間選擇40 min為宜。

2.2.3 液料比對(duì)多酚得率的影響

稱取 1.00 g樣品，在溫度為 50 ℃，pH 4.0，加酶量4%，反應(yīng)時(shí)間40 min的條件下，液料比分別為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 下提取，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚的含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)多酚得率的影響

由圖3可知，隨著液料比的增加，多酚得率隨之提高，但是到達(dá)了一定程度后得率反而會(huì)有降低的趨勢。這可能是因?yàn)殡S著液料比的增大，多酚溶出增加，當(dāng)液料比達(dá)到25∶1，多酚溶出基本平衡，而隨著液料比的進(jìn)一步增加，溶液體積加大，加大了與空氣接觸面從而導(dǎo)致部分多酚被氧化，進(jìn)而多酚得率有所下降，另外增加提取液會(huì)使提取成本加大，綜合考慮，液料比選取25∶1比較合理。

2.2.4 pH對(duì)多酚得率的影響

稱取1.00 g樣品，在溫度為50℃，液料比25∶1，加酶量4% 的條件下，分別調(diào) pH 為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，提取 40 min，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚的含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)多酚得率的影響

由圖4可知，隨著pH的升高，多酚得率逐步增加，pH 5.0時(shí)多酚得率最高，為較優(yōu)提取條件。

2.2.5 溫度對(duì)多酚得率的影響

稱取1.00 g 樣品，在液料比 20∶1，pH 5.0，加酶量4%的條件下，反應(yīng)溫度分別為 40、45、50、55、60、65℃下提取40 min，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚的含量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對(duì)多酚得率的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，多酚得率逐漸升高，50℃后多酚的提取效果反而下降。這可能是因?yàn)闇囟冗^高使得多酚氧化，酶的活性降低，進(jìn)而引起得率下降，故選反應(yīng)溫度為50℃。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 水酶法提取菜籽粕多酚的響應(yīng)面組合設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design－Expert對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到菜籽粕多酚得率對(duì)以上4個(gè)因素的回歸方程為:

Y=6.405+0.058X1+0.149X2+0.064X3+0.039X4－ 0.254X1X1+0.032X1X2+0.032X1X3－0.245X2X2+0.075X2X3－0.030X2X4－0.234X3X3+0.004X3X4－0.044X4X4

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型P＜0.01，表明回歸模型極顯著;模型的一次項(xiàng)X2極顯著，X1、X3顯著;X4不顯著，各因子顯著性順序?yàn)?加酶量(X2)＞溫度(X3)＞pH(X1)＞反應(yīng)時(shí)間(X4);二次項(xiàng) X21、X22、X23均極顯著;說明各因子對(duì)響應(yīng)值(提取率)的影響不是簡單的線性關(guān)系。各試驗(yàn)因子與響應(yīng)面的關(guān)系中，其因變量和全體自變量之間的關(guān)系顯著，r=93.59%，說明響應(yīng)值的變化有93.59%來源于所選變量，即pH、加酶量、溫度、反應(yīng)時(shí)間。失擬項(xiàng)不顯著，說明擬合程度較好。整體分析來看，回歸模型的擬合程度較好，可以用上述回歸方程對(duì)糖化酶提取菜籽粕多酚的試驗(yàn)加過進(jìn)行分析預(yù)測和確定最佳提取工藝條件。

表3 回歸模型方差分析

由表4中可以看出，4個(gè)因素的特征值都為負(fù)，表明有極值。由SAS軟件分析，得出各因素最優(yōu)水平組合為:X1=0.146 3，X2=0.321 2，X3=0.201 5，X4=0.341 5，Y=6.446 0，即 pH 5.07，加酶量4.32%，溫度 50.10 ℃，反應(yīng)時(shí)間 43.41 min，考慮實(shí)際情況，修正提取工藝條件為:pH 5.0，加酶量4.3%，溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間43 min。在此條件下重復(fù)試驗(yàn)4次，得平均多酚得率為6.43 mg/g，誤差為0.25%，說明采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)尋求的最佳工藝條件可行。

表4 典型分析表

3 結(jié)論

采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，得到水酶法提取菜籽粕多酚的最佳工藝條件:液料比 25∶1，pH 5.0，加酶量 4.3%，溫度 50 ℃，時(shí)間43 min，此時(shí)多酚得率為6.43 mg/g。而在不加糖化酶，其他條件相同情況下，水提菜籽多酚得率4.89 mg/g。相比較水提法提取菜籽多酚，水酶法菜籽多酚含量提高了31.49%，并且該法條件溫和，成本較低。

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Study on the Aqueous Enzymatic Extraction of Polyphenol from Rapeseed Cake

Xiao DiWang Chengming
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

Polyphenol is the main anti－ nutritional substance in the rapeseed meal，which has a more extensive utility in the food industry and other areas.Therefore，the reasonable application of the rapeseed protein application is limited.Aqueous enzymatic extraction of polyphenol from rapeseed meal was studied by adopting response surface methodology design.Four factors of pH value，addition of glucoamylase，temperature and reaction time were investigated on the basis of single factor test.By analyzing the response surface plots，the extraction parameters were optimized.Results showed that the optimal aqueous enzymatic extraction，namely using 4.3%glucoamylase to extract the powdered material with a particle size of 80 mesh at a liquid/material ratio of 25∶1(mL/g)with pH 5.0 under 50 ℃ for 43 min，resulted in a polyphenol yield of up to 6.43 mg/g.

rapeseed meal，polyphenol，extraction，aqueous enzymatic，response surface method

S565

A

1003－0174(2012)04－0050－05

2011－07－26

肖頔，女，1986年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏

王承明，男，1964年出生，教授，博士生導(dǎo)師，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，食品安全，食品化學(xué)