章雅清，陸惠玲，姚亞楠

（1.海南省血液中心法醫(yī)物證司法鑒定所，海南 ?？?570311；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證教研室，廣東 廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080）

增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-11鑒定月經(jīng)血

章雅清1，2，陸惠玲2，姚亞楠3

（1.海南省血液中心法醫(yī)物證司法鑒定所，海南 ?？?570311；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證教研室，廣東 廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080）

目的 探討增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)人基質(zhì)金屬蛋白酶-11（matrix metalloproteinase-11，MMP-11）鑒定月經(jīng)血的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。 方法 運(yùn)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)月經(jīng)血痕、陰道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑和精液斑中的MMP-11，考察MMP-11的組織特異性、穩(wěn)定性及檢測(cè)方法的靈敏度。 結(jié)果 月經(jīng)血痕中MMP-11蛋白的檢測(cè)陽性率為89.47%，陰道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑和精液斑中均未檢出MMP-11。當(dāng)上樣量為25μL時(shí)，蛋白質(zhì)量濃度為1.329μg/μL，可檢出MMP-11。4℃放置20個(gè)月的MMP-11陽性的月經(jīng)血痕，檢測(cè)陽性率為89.58%。 結(jié)論 用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)MMP-11蛋白的方法靈敏度高、特異性好，能用于月經(jīng)血與外周血、陰道液等常見斑痕的鑒別。

法醫(yī)遺傳學(xué)；化學(xué)發(fā)光測(cè)定法；基質(zhì)金屬蛋白酶-11；月經(jīng)血

在法醫(yī)學(xué)血痕檢驗(yàn)中，有時(shí)出血部位的確認(rèn)，尤其是月經(jīng)血的確認(rèn)顯得非常重要。目前研究表明，人基質(zhì)金屬蛋白酶-11（matrix metalloproteinase-11，MMP-11）可作為鑒定月經(jīng)血的標(biāo)志物[1-3]。本研究采用本課題組前期制備的兔抗人MMP-11多克隆抗體[4-5]，運(yùn)用免疫印跡法轉(zhuǎn)膜、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，檢測(cè)MMP-11，以期為鑒定月經(jīng)血提供科學(xué)、可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

選擇健康、月經(jīng)周期正常的志愿者33名，分別收集經(jīng)期第1～4天內(nèi)的月經(jīng)血痕，其中2名志愿者提供3個(gè)經(jīng)期（第1～4天）的月經(jīng)血痕，共114份。收集健康女性的陰道拭子、外周血痕、唾液斑及尿液斑各30例；健康男性精液17例，移至干凈紗布晾干。以上標(biāo)本于4℃保存。

1.1.2 主要試劑

MMP-11蛋白陽性對(duì)照液，由本課題組前期制備[4]；兔抗人MMP-11多克隆抗體，由本課題組前期制備[4-6]；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL發(fā)光液購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 各種斑痕中MMP-11的檢測(cè)

分別剪取4℃保存1個(gè)月內(nèi)的月經(jīng)血痕、陰道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑、精液斑約10mm×10mm，置微量離心管中，加入預(yù)冷的裂解液（50mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，150mmol/L NaCl，1%NP-40，0.5%SDC，0.1%SDS，1 μg/mL抑肽酶，0.02%疊氮鈉）100 μL，加入100 mmol/L PMSF 1 μL，于4℃浸泡1 h。4℃下以5000×g，離心10min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。取60μg的總蛋白樣本經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉2h，將膜浸入1∶1000稀釋的自制兔抗人MMP-11多克隆抗體內(nèi)，置濕盒4℃孵育過夜；將膜浸入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體內(nèi)，室溫孵育1.5 h；在膜上滴加發(fā)光液，1～2 min后將X線膠片覆蓋在膜上曝光1～5 min，顯影液沖洗3～5 min，定影液中漂洗，直至膠片出現(xiàn)清晰的條帶。

1.2.2 靈敏度及穩(wěn)定性檢測(cè)

剪取MMP-11檢測(cè)陽性的月經(jīng)血痕約20 mm× 20 mm，加入預(yù)冷的裂解液200 μL和100 mmol/L的PMSF 2 μL，于4℃浸泡1 h，4℃下以5 000×g，離心10min。取上清液，進(jìn)行蛋白定量，制成含不同蛋白量的樣本系列進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。取本課題組前期收集的于4℃放置20個(gè)月的MMP-11陽性的月經(jīng)血痕48份進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各種斑痕MMP-11的檢測(cè)結(jié)果

114份月經(jīng)血中有102份MMP-11蛋白檢測(cè)陽性，陽性率為89.47%（表1）。33名志愿者除1名志愿者4 d的月經(jīng)血痕均陰性外，其余32名均能檢測(cè)到MMP-11；2名提供3個(gè)經(jīng)期月經(jīng)血的志愿者，其3個(gè)經(jīng)期的月經(jīng)血痕MMP-11檢測(cè)結(jié)果均為陽性。陰道拭子、外周血痕、唾液斑、尿液斑和精液斑中均未檢出MMP-11（圖1）。

表1 33名志愿者1～4d月經(jīng)血MMP-11檢測(cè)結(jié)果（份）

圖1 各種斑痕MMP-11的檢測(cè)結(jié)果

2.2 靈敏度及穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 靈敏度檢測(cè)

方法靈敏度結(jié)果見圖2，當(dāng)上樣量為25 μL時(shí)，蛋白質(zhì)量濃度為1.329μg/μL，即可檢測(cè)出MMP-11。

圖2 月經(jīng)血痕MMP-11的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 穩(wěn)定性檢測(cè)

48份4℃保存20個(gè)月的MMP-11陽性的月經(jīng)血痕有43份檢測(cè)出MMP-11，陽性率為89.58%。

3 討 論

MMP-11是人基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的成員，在月經(jīng)周期中表達(dá)量明顯高于其他MMP的含量，尤其在子宮內(nèi)膜脫落形成月經(jīng)血的階段最為明顯，這種特征性的變化提示MMP-11可作為鑒定月經(jīng)血的標(biāo)志物[1-3]。國外學(xué)者采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MMP-11 mRNA的方法來鑒別月經(jīng)血和其他損傷出血[7-8]。但RNA的穩(wěn)定性較差，RT-PCR方法技術(shù)要求又高，操作過程相對(duì)繁瑣、耗時(shí)，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)的成本也較高。這些不利因素嚴(yán)重阻礙了MMP-11 mRNA在法醫(yī)學(xué)實(shí)際工作中的應(yīng)用。

免疫印跡法（immunoblotting）又稱蛋白印跡法（Western blotting）是檢測(cè)樣品中是否存在蛋白抗原的一種免疫化學(xué)方法。其借助SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白抗原分離，然后轉(zhuǎn)印到膜上，再用特異性抗體確定抗原。根據(jù)標(biāo)記二抗的標(biāo)記物不同，其雜交的結(jié)果檢測(cè)方法也不同，較常用的檢測(cè)系統(tǒng)有辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法和3′，3′二氨基聯(lián)苯胺（DAB）檢測(cè)系統(tǒng)。

DAB可以和辣根過氧化物酶作用形成褐色不溶性產(chǎn)物，靈敏度高、特異性好，但膜顯色后光照數(shù)小時(shí)會(huì)褪色，不能永久保存，而且試劑有毒。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法是在辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的反應(yīng)中添加了一些增強(qiáng)劑，以加強(qiáng)反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。隨著靈敏度更高的發(fā)光底物的研制，化學(xué)發(fā)光法的靈敏度已經(jīng)達(dá)到pg級(jí)別。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)點(diǎn)是：（1）顯色后的膠片能長期保存；（2）特異性好，通過調(diào)整曝光時(shí)間可以控制非特異條帶的出現(xiàn)。本試驗(yàn)采用1～5min的曝光時(shí)間，顯帶圖譜清晰，月經(jīng)血痕只有一條特異帶，其他斑痕未見任何條帶，完全消除了非特異條帶。

本實(shí)驗(yàn)采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法對(duì)114份月經(jīng)血痕進(jìn)行檢測(cè)，MMP-11檢出的陽性率為89.47%。姚亞楠等[5]用DAB顯色檢測(cè)105份月經(jīng)血痕，陽性率為88.57%（93/105）。Bauer[8]檢測(cè)66份月經(jīng)血痕MMP-11 mRNA的陽性率為84.8%。本方法的陽性率與其他兩種方法基本一致。

Ferri等[9]對(duì)1例室溫放置1年以上的月經(jīng)血痕進(jìn)行MMP-11 mRNA的特異檢測(cè)，結(jié)果仍為陽性。姚亞楠等[5]對(duì)在4℃保存12個(gè)月的MMP-11陽性的月經(jīng)血痕再次檢測(cè)MMP-11，成功率為91.67%（11/12）；對(duì)在室溫下放置12周的陽性月經(jīng)血痕檢測(cè)MMP-11，成功率為75.0%（9/12）。本實(shí)驗(yàn)對(duì)在4℃保存20個(gè)月的48份陽性月經(jīng)血痕檢測(cè)MMP-11，陽性率為89.58%。這說明MMP-11抗原穩(wěn)定性較好，在4℃條件下能保存較長時(shí)間。

姚亞楠等[5]采用免疫印跡DAB顯色方法檢測(cè)MMP-11，靈敏度為月經(jīng)血蛋白量≥39.76μg（相當(dāng)于月經(jīng)血1.5μL）。本研究采用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)MMP-11，當(dāng)上樣量為25μL時(shí)，蛋白質(zhì)量濃度為1.329μg/μL，可檢出MMP-11，略高于DAB顯色法。

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)是病理學(xué)較為常用的一種研究方法，能進(jìn)行特定組織和細(xì)胞中陽性信號(hào)的定位，直接觀察抗原在細(xì)胞和間質(zhì)中的存在，證實(shí)和解決許多常規(guī)染色難以判定的問題[6]。姚亞楠等[6]采用鏈霉卵白素-堿性磷酸酶（SAP）免疫組化法，對(duì)MMP-11的組織特異性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，MMP-11有選擇性地富集于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。但免疫組化需要目的蛋白有一定量的表達(dá)才可以檢測(cè)到，而且結(jié)果比較主觀，染色深淺受很多因素影響，有時(shí)會(huì)有假陽性，不易與背景區(qū)分；且靈敏度相對(duì)較低，試驗(yàn)所需抗體量較多。Western blotting方法則可以借助凝膠電泳將檢品中的雜蛋白進(jìn)行分離，加上分子量對(duì)照和內(nèi)參照，可以準(zhǔn)確地判斷目的蛋白，結(jié)果更客觀，并且可用于微量蛋白表達(dá)的研究和半定量分析。從質(zhì)量控制的角度講，Western blotting優(yōu)于免疫組化方法。姚亞楠等[6]用免疫組化法檢測(cè)放置1個(gè)月的月經(jīng)血痕，雖能檢見MMP-11陽性染色顆粒，但特異信號(hào)微弱。本實(shí)驗(yàn)對(duì)放置20個(gè)月的血痕采用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，在膠片上依然可以看到清晰的MMP-11特異性條帶。本研究的結(jié)果證實(shí)Western blotting法較靈敏可靠，可用于月經(jīng)血痕的檢測(cè)，更適用于法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐。

目前膠體金標(biāo)記的試劑條已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證檢測(cè)中，如果能按照金標(biāo)試劑條的制作原理，制作檢測(cè)MMP-11蛋白的試劑條，將使鑒定月經(jīng)血的方法更簡(jiǎn)便、快捷。

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2011-12-14）

（本文編輯：李成濤）

Detection of Matrix Metalloproteinase-11 in Menstrual Blood by Enhanced Chemiluminescence Method

ZHANG Ya-qing1,2,LU Hui-ling2,YAO Ya-nan3
（1.Forensic Judical Appraisal Institute,Blood Center of Hainan Province,Haikou 570311,China;2.Department of Forensic Biology,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China; 3.The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China）

Objective To explore the forensic application value of detection of matrix metalloproteinase-11（MMP-11）in menstrual blood by enhanced chemiluminescence method.Methods Menstrual blood,vaginal swab,peripheral blood,saliva stain,urine stain and semen stain were collected to detect whether or not there were MMP-11 using enhanced chemiluminescence method.The specificity and reliability of the MMP-11 assay along with its sensitivity were evaluated.Results The positive detection rate of MMP-11 in menstrual blood was 89.47%,whereas no MMP-11 was found in vaginal swab,peripheral blood,saliva stain,urine stain and semen stain.When 25 μL sample was added,the mass concentration of protein was 1.329μg/μL,then MMP-11 could be detected.A positive detection rate of 89.58%was observed in MMP-11 positive menstrual blood samples after stored at 4℃ for 20 months.Conclusion Enhanced chemiluminescence method is sensitive and specific for detecting MMP-11,and can be applied to distinguish menstrual blood from common stain such as peripheral blood,vaginal fluid.

forensic genetics;luminescent measurements;matrix metalloproteinase-11;menstrual blood

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.008

1004-5619（2012）02-0109-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30471933）

章雅清（1979—）女，山西人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：fywzzyq2005@yahoo.com.cn

陸惠玲，女，教授，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：luhl@mail.sysu.edu.cn