徐文 孫術(shù)紅 劉濤 馬敏 隋忠國(guó)

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島266002）

藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)化依賴于體內(nèi)的藥物代謝酶。細(xì)胞色素P450，又稱為細(xì)胞色素P450 混合功能氧化酶系（簡(jiǎn)稱細(xì)胞色素酶或CYP），是人體內(nèi)最重要的藥物代謝酶，參與絕大多數(shù)藥物和部分內(nèi)源性物質(zhì)的體內(nèi)代謝[1-3]。其中，CYP3A4約占人肝臟中細(xì)胞色素酶總量的30%，腸道中細(xì)胞色素酶的70%，參與約一半上市藥物的體內(nèi)代謝[4]。該酶的活性容易受到抑制，導(dǎo)致底物藥物的吸收增加或代謝變慢，加重毒副作用。西藥在研發(fā)階段必須考察對(duì)藥物代謝酶的誘導(dǎo)和抑制作用，以確保臨床合理用藥[5]；中藥在這方面的研究很少且更易對(duì)藥物代謝酶產(chǎn)生影響，因此，為保證臨床安全用藥，有必要研究其對(duì)藥物代謝酶的作用[6-7]。

金銀花是一種常用中藥，其提取物及復(fù)方制劑在抗菌、抗病毒方面有很強(qiáng)的活性且不易耐受[8-9]，但在臨床使用時(shí)多與化學(xué)藥物聯(lián)用，其中不乏CYP3A4 的底物藥物，如克林霉素、林可霉素、夫西地酸鈉、利福平、克拉霉素等。金銀花是否會(huì)導(dǎo)致藥物相互作用還未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了金銀花提取物及其3 個(gè)主要成分（綠原酸、咖啡酸和蘆?。?duì)CYP3A4 的活性影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

金銀花（由本院采購(gòu)辦公室采購(gòu)，產(chǎn)地山東，經(jīng)本院于良生主管藥師鑒定為正品）；rhCYP3A4、1′- 羥基咪達(dá)唑侖、葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶, 葡萄糖-6- 磷酸（Sigma 公司）；替硝唑、綠原酸、咖啡酸和蘆?。ㄔ袊?guó)藥品生物制品檢定所）；氧化型輔酶Ⅱ（NADP+）（Fluka 公司）；咪達(dá)唑侖注射液（江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；乙腈，色譜純（德國(guó)Merck 公司）；甲酸，色譜純（美國(guó)Tedia 公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

美國(guó)Agilent 6410B 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，配有G1311A 四元泵、G1322A 真空脫氣 機(jī)、G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器和G1316A 柱溫箱，使用Mass Hunter 軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理；色譜柱為美國(guó)Agilent ZORBAX SB-C18(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 金銀花提取物的制備

取金銀花100 g 加水1 L 浸漬30 min，煎煮1 h，再加水1 L，煎煮1 h，分次濾過(guò)，合并濾液，濃縮至100 mL，放冷至40℃，緩緩加入乙醇使含醇量達(dá)75%，充分?jǐn)嚢?，靜置12 h，濾取上清液，回收乙醇至無(wú)醇味，加入3 ～4 倍量水，調(diào)pH 至7.0，充分?jǐn)嚢璨⒓訜嶂练?，靜置48 h，濾取上清液，濃縮至100 mL)，放冷至40℃，加入乙醇使含醇量達(dá)85%，靜置12 h，濾取上清液，回收乙醇至無(wú)醇味，備用。

2.2 還原型輔酶Ⅱ（NADPH）生成系統(tǒng)的配制

將葡萄糖-6- 磷酸、NADP+和葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶加入到20 mmol/L 氯化鎂溶液中，濃度分別為40 mmol/L、4 mmol/L 和3.2 U/mL。該溶液分裝后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 rhCYP3A4 的孵化

反應(yīng)體系中先分別加入rhCYP3A4、探針底物咪達(dá)唑侖和待測(cè)藥物，置于37℃水浴中預(yù)孵化5 min，加入NADPH 生成系統(tǒng)啟動(dòng)反應(yīng)。在反應(yīng)體系中，rhCYP3A4、咪達(dá)唑侖、NADP+、氯化鎂、葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶、葡萄糖-6- 磷酸的濃度分別為50 nmol/L、5 μmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、0.8 U/mL 和10 mmol/L。37℃水浴振蕩反應(yīng)5 min后，加入冰乙腈（含內(nèi)標(biāo)替硝唑1 μg/mL）終止反應(yīng)。渦旋混合1 min，10 000×g 離心5 min，取上清液10 μL 加入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）系統(tǒng)測(cè)定咪達(dá)唑侖代謝產(chǎn)物1′- 羥基咪達(dá)唑侖的濃度。

實(shí)驗(yàn)均為雙樣本分析取平均值。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)不加待測(cè)藥物的陰性對(duì)照，即以加入等體積的溶劑替代待測(cè)藥物，加入待測(cè)藥物后生成的代謝產(chǎn)物的濃度與陰性對(duì)照相比，即可估算出待測(cè)藥物對(duì)藥物代謝酶活性的影響。

2.4 LC-MS/MS 測(cè)定1′- 羥基咪達(dá)唑侖的色譜和質(zhì)譜條件

6410B 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 公司）；ZORBAX SB-C18柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）（Agilent 公司），流動(dòng)相為乙腈-水-甲酸（40∶60∶0.3），流速0.3 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL；質(zhì)譜使用ESI 源，正離子模式，噴霧電壓4 000 V，源溫度105℃；霧化氣為氮?dú)?，霧化壓力40 psi；去溶劑氣為氮?dú)?，溫?50℃，流速10 L/min；碰撞氣為高純氮?dú)?，壓?.1 MPa；質(zhì)譜的半峰寬均為0.7 amu。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)藥物離子濃度進(jìn)行測(cè)定，m/z342.2 →324.2監(jiān)測(cè)1′-羥基米達(dá)唑侖,m/z248.2 →121.1 監(jiān)測(cè)替硝唑。

2.5 抑制作用強(qiáng)弱和作用類型判斷

在孵化體系中加入不同濃度的待測(cè)藥物，分別求得其抑制率，回歸計(jì)算IC50值。藥物對(duì)CYP3A4 的抑制作用用1′- 羥基咪達(dá)唑侖生成速率的降低來(lái)表示，以溶劑對(duì)照時(shí)1′- 羥基咪達(dá)唑侖的生成速率為100%，加入待測(cè)藥物后1′- 羥基咪達(dá)唑侖的生成速率為剩余活性，本實(shí)驗(yàn)用后者與前者的比值即剩余活性百分率表示藥物對(duì)酶活性抑制作用的強(qiáng)弱，數(shù)值越低表示抑制作用越強(qiáng)。

抑制作用類型的判斷則采用固定待測(cè)藥物濃度（接近IC50值），改變預(yù)孵化時(shí)間和探針底物加入順序，即先加入待測(cè)藥物、NADPH 生成系統(tǒng)分別預(yù)孵化5、10、20、30 和60 min 后加入探針底物（咪達(dá)唑侖），其余操作不變。如果藥物的抑制作用不受孵化時(shí)間的影響則為非抑制作用；如果抑制作用隨孵化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加則為不可逆抑制作用。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度的金銀花提取物、綠原酸、咖啡酸和蘆丁對(duì)CYP3A4 的抑制作用見(jiàn)圖1，其中金銀花提取物的濃度單位mg/mL 是指每毫升中相當(dāng)于原藥材的質(zhì)量。

圖1 金銀花提取物（A）、綠原酸（B）、咖啡酸（C）和蘆?。―）對(duì)CYP3A4 的抑制作用量效曲線

由圖1 可見(jiàn)，所測(cè)定的金銀花提取物及其3 個(gè)主要成分均對(duì)CYP3A4 有一定的抑制作用，且隨著孵育體系中藥物濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)（CYP3A4 的剩余活性下降）。抑制作用的IC50值分別為2.13 mg/mL（金銀花提取物）、28.8 μmol/L 綠原酸）、74.06 μmol/L（咖啡酸）和17.6 μmol/L（蘆?。?。咖啡酸的抑制作用很弱，幾乎不會(huì)導(dǎo)致藥物相互作用，故不進(jìn)行下一步研究。

3.2 抑制類型判斷

不同預(yù)孵化時(shí)間對(duì)綠原酸和蘆丁抑制作用的影響見(jiàn)圖2。

由圖2 可見(jiàn)，在5 ～30 min 預(yù)孵化時(shí)間內(nèi)，綠原酸的抑制作用迅速增加，繼續(xù)延長(zhǎng)預(yù)孵化時(shí)間，對(duì)酶活性的抑制作用略增加，可見(jiàn)綠原酸對(duì)CYP3A4 有不可逆抑制作用；蘆丁對(duì)CYP3A4 的抑制作用受預(yù)孵化時(shí)間的影響與綠原酸類似，也是不可逆抑制作用。

圖2 預(yù)孵化時(shí)間綠原酸（A）和蘆?。˙）對(duì)CYP3A4 的抑制作用的影響

4 討論

藥物對(duì)藥物代謝酶的作用包括抑制作用、激動(dòng)作用、誘導(dǎo)作用和表達(dá)下調(diào)作用，其中最常發(fā)生的抑制作用分為可逆抑制與不可逆抑制，而可逆抑制又包括競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制等[10]。對(duì)于可逆抑制，當(dāng)提高底物藥物的用量時(shí)，這種相互作用可部分抵消甚至完全抵消；而對(duì)于不可逆抑制，則是藥物代謝酶完全失活，藥物代謝酶作為一種特殊的蛋白質(zhì)需要機(jī)體重新合成才能發(fā)揮作用，這個(gè)過(guò)程需要幾天的時(shí)間，所以此類藥物相互作用即使兩藥間隔數(shù)天服用也可能發(fā)生[11]。

目前對(duì)于中藥抑制作用的強(qiáng)弱還沒(méi)有公認(rèn)的判斷依據(jù)，本研究暫按化學(xué)藥物的抑制作用的判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)。一般化學(xué)藥物的抑制作用的IC50低于1 μmol/L容易導(dǎo)致藥物相互作用；1 ～10 μmol/L 之間可能會(huì)導(dǎo)致藥物相互作用；大于10 μmol/L 不容易導(dǎo)致藥物相互作用。但是對(duì)于不可逆抑制，10 ～50 μmol/L 也可能會(huì)導(dǎo)致藥物相互作用。由此判斷，綠原酸和蘆丁均有可能導(dǎo)致藥物的相互作用。且這些藥物的抑制作用相加導(dǎo)致發(fā)生藥物相互作用的可能性增加。所以，在使用CYP3A4 的底物藥物，如克林霉素、他汀類血脂調(diào)節(jié)藥物、環(huán)孢素等免疫抑制劑時(shí)應(yīng)避免與含有金銀花的藥物聯(lián)用；如果必須聯(lián)用，應(yīng)注意這些底物藥物的吸收及毒副作用可能增加，且這種相互作用在停用含金銀花的藥物數(shù)天內(nèi)也有可能發(fā)生。

[1] 鐘大放.藥物代謝[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1996：1-6.

[2] 冷欣夫，邱星輝.細(xì)胞色素P450 酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景[M].北京：科學(xué)出版社，2001：56-57.

[3] Forrester LM，Henderson CJ，Glancey MJ，et al. Relative expression of cytochrome P450 isoenzymes in human liver and association with metabolism of drugs and xenobiotics [J]. Biochem J，1992，281（Pt2）：359-368.

[4] Lin JH，Lu AY. Inhibition and induction of cytochrome P450 and the clinical implications[J]. Clin Pharmacokinet，1998，35（5）:361-390.

[5] Hengstler JG，Bolt HM. Failure in drug development: the role of inhibition and induction of cytochrome P450 enzymes [J]. Arch Toxicol，2008，82（10）:665-666.

[6] Foti RS，Wahlstrom JL，Wienkers LC. Thein vitrodrug interaction potential of dietary supplements containing multiple herbal components[J].Drug Metab Dispos，2007，35（2）：185-188.

[7] Lee LS，Andrade AS，F(xiàn)lexner C. Interactions between Natural Health Products and Antiretroviral Drugs: Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Effects [J]. Clin Infect Dis，2006，43（8）:1052-1059.

[8] 李澤庚，張國(guó)梁，尚麗莉，等.中藥注射劑在手足口病中的應(yīng)用概況[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2010，22（7）：582-584.

[9] 宋志香，李劉坤，李興廣. 中藥痰熱清注射液治療MRSA 感染性肺炎的臨床觀察研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（11）：1596-1598.

[10] Lim HK，Duczak N Jr，Brougham L，et al.Automated screening with confirmation of mechanism-based interaction of CYP3A4，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，and CYP1A2 in pooled human liver microsomes [J]. Drug Metab Dispos，2005，33 (8)：1211-1219.

[11] Stresser DM，Broudy MI，Ho T，et al. Highly selective inhibition of human CYP3Ain vitroby azamulin and evidence that inhibition is irreversible[J]. Drug Metab Dispos，2004，32（1）：105-112.