劉峰 董輝 （山東省濟(jì)南市長清區(qū)文昌畜牧獸醫(yī)站 250300）

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禽J亞群白血病的PCR鑒定與病理學(xué)分析

劉峰 董輝 （山東省濟(jì)南市長清區(qū)文昌畜牧獸醫(yī)站 250300）

對山東濟(jì)南某蛋雞養(yǎng)殖場送檢的5只發(fā)病雞，通過PCR方法進(jìn)行實驗室診斷并進(jìn)行病理組織學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病雞肝、脾、腎等組織器官顯著腫大并有灰白色腫瘤結(jié)節(jié)，瘤細(xì)胞為髓樣細(xì)胞；取病死雞的肝臟、肺臟提取DNA樣本，從中擴(kuò)增出ALV-J亞群特異性的病毒核酸。上述檢測結(jié)果判定該病例為髓細(xì)胞瘤型禽J亞型白血病。取病雞內(nèi)臟器官進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，HE染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤組織主要由髓樣瘤細(xì)胞組成，心、腎、肝等可見髓樣瘤細(xì)胞浸潤。

J亞群白血病 PCR診斷 病理組織學(xué) 腫瘤

禽白血病(Avian leucosis)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)禽白血病/肉瘤病毒群(Avian leucosis /sarcoma virus)引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱。禽白血病病毒為反轉(zhuǎn)錄病毒科、反轉(zhuǎn)錄病毒屬[1]。根據(jù)病毒囊膜蛋白的抗原差異、病毒干擾試驗、宿主范圍和基因組的分子生物學(xué)特性，禽白血病肉瘤病毒群分為10個亞群，分別以A-J命名[2]。1989年，Payne等首次從肉種雞群中分離出J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subtype J，ALV-J)[3]。最初ALV-J主要引起成年肉雞以骨髓細(xì)胞瘤為主的白血病，感染雞群發(fā)生腫瘤，生產(chǎn)性能降低，死亡率增高，造成嚴(yán)重的損失[4,5]。近幾年發(fā)現(xiàn)該病在蛋雞發(fā)病率逐漸增高。

山東濟(jì)南某蛋雞養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖商品蛋雞5000套，于100日齡左右開始零星發(fā)病，一個月內(nèi)死亡約10只，送1只病雞到山農(nóng)業(yè)大學(xué)動物臨床病理實驗室進(jìn)行疾病診斷。PCR鑒定后進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1 材料與方法

1.1 材料 山東省濟(jì)南市某商品蛋雞場送檢的1只發(fā)病產(chǎn)蛋雞(150日齡)，引物由大連TaKaRa生物工程有限公司合成，組織DNA提取試劑盒、Taq酶購自上海生工，常規(guī)石蠟切片所需材料由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床病理實驗室提供。

1.2 禽白血病PCR鑒定 取病死雞肝臟、肺臟、骨髓等病料研磨組織勻漿液，12000r/min離心10min，取上清液，用試劑盒提取總DNA樣本。參照曲悅等方法，設(shè)計了一對引物：上游引物F：5’-GGATGAGGTGACTAAGA-3’,；下游引物R：5’-CGAACCAAAGGTAACACACG-3’)。引物以提取的DNA作為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR。PCR步驟參考李宏民[6]等略作修改：反應(yīng)體系分別加入template DNA1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTP (10mM)4μl、Tag酶1μl、P1+P2 引物(50μM)各1μl，添加ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體積為50μl。PCR反應(yīng)按下列條件進(jìn)行：95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35個循環(huán)：94℃變性1min、56℃退火40s、72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增完成以后，取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 病理學(xué)檢查 對病死雞進(jìn)行尸體剖檢，觀察并記錄大體病變。取具有眼觀病變的肝臟、脾臟、腎臟、心臟，10%福爾馬林溶液固定，石蠟切片，H.E染色，光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及病理剖檢變化 病雞消瘦，精神萎靡，食欲減退，雞冠、肉髯萎縮蒼白，腹部膨大，可觸摸到腫大的。肝臟腫大，幾乎占滿了整個腹腔，表面散在大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)呈灰白色；脾臟顯著腫大，有白色病灶；腎臟呈紅白相間花紋狀；心肌顏色偏淡，坐骨神經(jīng)未見明顯病變。

2.2 PCR鑒定 以F+R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從送檢病死雞的樣本中擴(kuò)增出目的DNA帶(見圖1)。

圖1 發(fā)病雞ALV-J特異性PCR結(jié)果

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：陽性對照；2：目的條帶

2.3 病理學(xué)觀察 可見腫瘤組織主要由髓樣瘤細(xì)胞組成，肝組織內(nèi)有大量髓樣瘤細(xì)胞呈灶狀或條索狀浸潤增生，病灶大小不一，多位于血管周圍，瘤細(xì)胞形態(tài)基本一致，細(xì)胞體積較大，胞漿豐富，染色稍淡，空泡狀(圖2A)。脾臟髓樣瘤細(xì)胞呈彌漫性增生，白髓淋巴細(xì)胞崩解壞死，數(shù)量明顯減少(圖2B)；腎臟中腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎小管壞死崩解，間質(zhì)有髓樣瘤細(xì)胞浸潤(圖2C)；心肌間質(zhì)內(nèi)也可見髓樣瘤細(xì)胞浸潤灶(圖2D)；而坐骨神經(jīng)則未見到細(xì)胞增生。

3 討論

我國于1999年在市場上商品代肉雞中第一次分離到ALV-J[7]，ALV-J的宿主范圍已由肉種雞擴(kuò)大到蛋雞以及地方品種雞[8~10]。目前，ALV-J已散布于世界各地，成為養(yǎng)禽業(yè)所面臨的主要病原之一。本病已經(jīng)對生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此對該病的檢測與防治尤為重要。

本研究中，該發(fā)病雞臨床及剖檢癥狀符合禽白血病的發(fā)病特點，病理學(xué)觀察具有髓細(xì)胞瘤的病變特征，PCR鑒定證實為ALV-J感染。要采取多種措施控制和消滅此病。此病毒可通過垂直或水平傳播，使用污染的生物制品是重要的傳染途徑，根據(jù)禽白血病的這些特點，可從以下幾個方面采取措施：（1）消除垂直傳播：本病以垂直傳播為主，早期診斷，淘汰帶毒種蛋和種雞，以凈化種群尚；（2）防止水平傳播：做好圈舍、飼料、飲水等的消毒工作，檢疫凈化，選擇使用非污染的生物制品是當(dāng)前防制該病的有效手段；（3）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：飼養(yǎng)管理好的雞群，機(jī)體免疫機(jī)能強(qiáng)，感染ALV幾率減小。

圖2 病雞病理組織學(xué)變化

A：肝臟髓樣瘤細(xì)胞增生 B：脾臟髓樣瘤細(xì)胞彌漫性增生 C：腎小管間髓樣瘤細(xì)胞浸潤 D：心臟髓樣瘤細(xì)胞增生

[1] 卡爾尼克BW.禽病學(xué)(第10版)[M]. 高福等譯. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999: 529.

[2] Payne L N. Developments in avain leucosisi research [J]. Leukemia, 1992, 6(3): 150-152.

[3] Payne L N, Brown S R, Bumstead N,. A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chicken[J]. J Gen Virol, 1991, 72: 801-807.

[4] 高玉龍,秦立廷,王笑梅. 2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2010(1): 32-35.

[5] 崔治中. 病診治彩色圖譜[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 41-43.

[6] 李宏民,劉蒙達(dá),孫洪磊等. 蘆花雞J亞群禽白血病的綜合診斷[J].中國家禽, 2011, 33(2): 55-56.

[7] 杜巖, 崔治中, 秦愛建等. 從市場商品肉雞中檢出J亞群禽白血病病毒[J]. 中國家禽學(xué)報, 1999,3(1): 1-4.

[8] Cui Z Z, Sun S H, Zhang Z, Meng S S. Simultaneous endemic infections with subgroup J avian leukosis virus and reticuloendotheliosis virus in commercial and local breeds of chickens. Avian Pathology, 2009, 38(6): 443-448.

[9] 成子強(qiáng), 張利, 劉思當(dāng)?shù)? 中國麻雞中發(fā)現(xiàn)禽J亞群白血病[J]. 微生物學(xué)報, 2005,45(4): 584-586.

[10] 高玉龍, 邵華斌, 羅青平等. 2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2010,32(1): 32-35.

（2012–07–10）

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