呂廣穎， 牟關(guān)敏， 楊海君

(西南科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

齊墩果酸(1)及其衍生物具有十分廣泛的生物活性，如護(hù)肝降酶、抗血小板凝聚、降血脂、抗炎、抗腫瘤、抑制潰瘍、抗微生物、降血糖、抗HIV等[1～3]，但由于其生物活性較弱，且生物利用度低，限制了在臨床上的應(yīng)用。

關(guān)于1的結(jié)構(gòu)改造研究報(bào)道較多[4～8]，在一定程度上提高了1的生物活性。如1的3-位碳羰基化或17-位羧基酰胺化后所得到的衍生物具有明顯的HIV抑制活性等[9,10]。A環(huán)開環(huán)的齊墩果酸衍生物具有較高的抑制前列腺NRP152和NRP154細(xì)胞生長的活性[11]。 Honda等[12]合成了一系列C環(huán)含有烯酮等結(jié)構(gòu)的齊墩果酸衍生物，并發(fā)現(xiàn)部分化合物具有良好的抑制一氧化氮生成的活性。此外，17-位羧基轉(zhuǎn)化為醛基的衍生物具有良好的癌細(xì)胞抑制作用等[13]。需要指出的是，大部分齊墩果酸衍生物都是在保持其基本結(jié)構(gòu)不變的情況下，基于1的3-位羥基，12-位雙鍵或者17-位羧基的簡單轉(zhuǎn)化或衍生。

Scheme1

實(shí)現(xiàn)1的骨架改變或者惰性甲基活化的方法，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新型活性化合物，實(shí)現(xiàn)1向其它重要化合物的轉(zhuǎn)化都具有重要的意義。如A環(huán)開環(huán)縮環(huán)，C環(huán)12-雙鍵斷裂的開環(huán)衍生物或甲基活化的齊墩果酸衍生物具有很好的生物活性[11,12]。 1的8和14-位季碳之間單鍵斷裂的C環(huán)開環(huán)衍生物，可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為十氫萘手性合成子，可用于合成含十氫萘結(jié)構(gòu)的重要天然產(chǎn)物[14～17]。 14-位甲基活化的方法可用于合成一些重要的活性天然產(chǎn)物，如Myriceric Acid A， Myricerone等[18]。但到目前為止，還沒有關(guān)于1的10-位甲基活化的研究報(bào)道，也沒有10-位甲基活化的齊墩果酸衍生物以及8,14-位單鍵斷裂的C環(huán)開環(huán)齊墩果酸衍生物的生物活性研究報(bào)道。

本文以1為原料，經(jīng)過3-位羥基乙?；?7-位羧基甲酯化，11-位碳羰基化以及光照反應(yīng)，首次成功實(shí)現(xiàn)了1的10-位角甲基活化，合成了新型的齊墩果酸衍生物——3β-乙酰氧基-11α-羥基-11,25-環(huán)-齊墩果-12-烯-28-酸甲酯(4， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)1H NMR，13C NMR， IR和MS表征。采用SRB法測(cè)試了1～9對(duì)N-04， Bre-04和Lu-04細(xì)胞株的體外抑制活性。結(jié)果表明，4， 8和9具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

X-6型精密顯微熔點(diǎn)儀(溫度計(jì)未校正)；Perkin Elmer 341型自動(dòng)旋光儀；Lambda 35型紫外光譜儀；Bruker Avance 600型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Perkin Elmer Spectrum One FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片)；Bruker Daltonics Bio-TOF-QⅢ型質(zhì)譜儀。

5～9參考文獻(xiàn)[14]方法合成；其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純；化合物采用一般的顯色方法(如I2，磷鉬酸，紫外，硫酸/乙醇)顯色。

1．2 合成

(1) 3β-乙酰氧基-齊墩果-12-烯-28-酸甲酯(2)的合成

在燒瓶中加入乙醚60 mL和40%KOH溶液20 mL，攪拌下于5 ℃以下分批加入甲基亞硝基硫脲6 g；反應(yīng)10 min，分出乙醚層得CH2N2乙醚溶液，用KOH干燥備用。

(2) 3β-乙酰氧基-11-氧代齊墩果-12-烯-28-酸甲酯(3)的合成

(3) 4的合成

1.3 抗腫瘤活性篩選

Sulforhodamine B(SBR)[20]在515 nm的吸光度與細(xì)胞數(shù)量呈良好的線性關(guān)系，可以作細(xì)胞數(shù)的定量。本文采用SRB法進(jìn)行抗腫瘤活性篩選。

將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10%小牛血清和不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含1%青、鏈霉素和谷氨酰銨，在5%CO2， 37 ℃孵箱中培養(yǎng)。首先將腫瘤細(xì)胞按一定密度接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后換用含有不同濃度受試藥物[用PBS配成1 μg·mL-1工作液，使用時(shí)按所需濃度用培養(yǎng)基稀釋，受試藥物濃度分別為(1．0×10-4， 1．0×10-5， 1．0×10-6， 1．0×10-7， 1．0×10-8) mol·L-1]的新鮮培養(yǎng)基，在5%CO2， 37 ℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在每孔加入50 μL預(yù)冷50%三氯乙酸(終濃度10%)，靜置5 min后放置冰箱中，于4 ℃冷藏1 h。蒸餾水洗滌5次，空氣干燥，加入100 μL SRB染液(用1%醋酸配制成0.4%溶液)，在搖床上低速搖動(dòng)進(jìn)行染色處理細(xì)胞10 min；再用1%醋酸溶液洗滌細(xì)胞4次，在搖床上低速搖動(dòng)，每次5 min，用于除去未結(jié)合染料；洗滌4次后進(jìn)行空氣干燥；加入150 μL 10 mmol·L-1非緩沖Tris溶液溶解結(jié)合染料，充分混勻后，經(jīng)酶標(biāo)儀在515 nm處測(cè)定并計(jì)算GI50。各個(gè)樣品的作用強(qiáng)度通過GI50進(jìn)行比較。一般認(rèn)為有效標(biāo)準(zhǔn)為GI50<10 μmol·L-1。

2 結(jié)果與討論

2．1 合成

參考文獻(xiàn)[19，21]方法合成2。 2具有12-位碳碳雙鍵，可以通過烯丙位羰基化的方法在11-位引入羰基得到3。烯丙位羰基化的方法很多，如CrO3/Py， PDC， PCC，鉻酸鈉/乙酸，重鉻酸鈉/乙酸，氟鉻酸吡啶嗡鹽， RuCl2(PPh3)3， Mn3O(OAc)9/tBuO2H/O2和NaClO2/tBuO2H等[22，23]。本文采用CrO3/吡啶作為烯丙位氧化試劑，以67%的產(chǎn)率得到11-位羰基化產(chǎn)物3。但該反應(yīng)幾倍當(dāng)量的CrO3，環(huán)境污染嚴(yán)重，后處理十分繁瑣。嘗試采用KMnO4(堿性或中性)或KMnO4/KIO4(堿性或中性)等氧化劑氧化2，意外地發(fā)現(xiàn)該氧化劑也能實(shí)現(xiàn)1的11-位羰基化得到3，但產(chǎn)率較低(30%～40%)。 1含有7個(gè)角甲基，一般而言都是很惰性的，很難發(fā)生一般的化學(xué)反應(yīng)。角甲基的活化，對(duì)于1的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化、新型衍生物的制備及活性化合物發(fā)現(xiàn)等具有重要價(jià)值。目前，可以通過亞硝酸酯的Barton光化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)14-位甲基的活化，也可通過Na2PdCl4試劑實(shí)現(xiàn)4α-甲基的活化，但還沒有1的10-位甲基活化的研究報(bào)道。11-位羰基的甾體化合物在光照的情況下可以實(shí)現(xiàn)甾體化合物10-位甲基的活化，得到甲基活化的新型甾體衍生物[23,24]。本文參照甾體甲基活化的方法，將3溶于乙醇中，在高壓紫外汞燈的照射下，成功地實(shí)現(xiàn)了1的10-位甲基的活化，得到唯一的具有環(huán)丁醇結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物4。

2．2 抗腫瘤活性

為了考察1的10-位甲基活化及8,14-位單鍵斷裂對(duì)于其生物活性的影響，對(duì)1～9進(jìn)行了生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)1及其簡單衍生物2，3和5～7在所篩選的條件下不具有生物活性。而4,8和9有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性(表1)。結(jié)果表明，1的10-位甲基活化及8,14-位單鍵斷裂可提高抗腫瘤活性。這也為進(jìn)一步結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究提供了參考。

表1 抗腫瘤活性篩選結(jié)果Table 1 Results of Anti-tumor activities screening

[1] 田麗婷，馬龍，堵年生. 齊墩果酸的藥理作用研究概況[J].中國中藥雜志,2002,27(12):884-886.

[2] 鄒懷波,周蓉. 烏索酸與齊墩果酸衍生物的合成進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009,21:361-363.

[3] 張蜀艷,李政. 齊墩果酸研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(4):20-24.

[4] Bednarczyk-Cwynar B, Zaprutko L, Ruszkowskib P,etal. Anticancer effect of A-ring or/and C-ring modified oleanolic acid derivatives on KB,MCF-7 and HeLa cell lines[J].Org Biomol Chem,2012,10:2201-2205.

[5] Finlay H J, Honda T, Gribble G W,etal. Novel A-ring cleaved analogs of oleanolic acid and ursolic acid which affect growth regulation in NRP.152 prostate cells[J].Bioorg Med Chem Lett,1997,7(13):1769-1772.

[6] 鄭開波,毛海立,孫成斌,等. 齊墩果酸結(jié)構(gòu)修飾及抗腫瘤活性的研究[J].黔南師范學(xué)院學(xué)報(bào),2009,6:11-14.

[7] 李群林,顧軍,李靈芝. 齊墩果酸衍生物的合成[J].合成化學(xué),2010,18(3):290-296.

[8] Konoike T, Takahashi K, Kitaura Y,etal. Synthesis of [2-13C]-oleanolic acid and [2-13C]-myricerone[J].Tetrahedron,1999,55:14901-14914.

[9] Ma C M, Nakamura N, Miyashiro H,etal. Inhibitory effects of constituents from cynomorium songaricum and related triterpene derivatives on HIV-1 protease[J〗].Chem Pharm Bull,1999,47(2):141-145.

[10] Hondaa T, Finlaya H J, Gribblea G W,etal. New enone derivatives of oleanolic acid and ursolic acid as inhibitors of nitric oxide production in mouse macrophages[J].Bioorg Med Chem Lett,1997,7(13):1623-1628.

[11] Finlaya H J, Hondaa T, Gribblea, G W,etal. Novel A-ring cleaved analogs of oleanolic and ursolic acids which affect growth regulation in NRP.152 prostate cells[J].Bioorg Med Chem Lett,1997,7(13):1769-1772.

[12] Honda T, Rounds B V, Bore L,etal. Synthetic oleanane and ursane triterpenoids with modified rings A and C:A series of highly active iInhibitors of nitric oxide production in mouse macrophages[J].J Med Chem,2000,43:4233-4246.

[13] 趙龍鉉,宋蕾蕾,周曉琳,等. 2α,3β-二羥基齊墩果烷-12-烯-28β-醛的合成、表征及抗腫瘤活性研究[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào),2010,5:28-33.

[14] Yang H J, Li B G, Cai X H,etalChiral decalins:Preparation from oleanolic acid and application in the synthesis of (-)-9-epi-ambrox[J].J Nat Prod,2006,69(11):1531-1538.

[15] Xie Y P, Li B G, Luo Y G,etal. Preparation of two diastereoisomeric decalin synthons and (-)-ambrox[J].HELV CHIM ACTA,2008,91:734-740.

[16] 李春玲,楊海君,劉燕,等. 齊墩果烷型二烯酮化合物的氧化研究[J].有機(jī)化學(xué),2011,31(5):665-671.

[17] 劉燕,楊海君,李春玲,等. 齊墩果酸乙酰氧基取代三烯的合成及氧化[J].應(yīng)用化學(xué),2011,28(2):182-187.

[18] Konoike T, Oda K, Uenaka M,etal. Practical large-scale synthesis of endothelin receptor antagonist S-0139[J].Org Process Res Dev,1999,3:347-351.

[19] Begum S, Sultana I, Siddiqui B S,etal. Structure and spasmolytic activity of eucalyptanoic acid from eucalyptus camaldulensis var. Obtusa and synthesis of its active derivative from oleanolic acid[J].J Nat Prod,2002,65(12)：1939-1941.

[20] Skehan P, Storeng R, Scudiero D. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J].J Natl Cancer I,1990,82(13):1107-1112.

[21] Gil M, Ha?dour A, Ramos J L. Identification of two triterpenoids in solid wastes from olive cake[J].J Agric Food Chem,1997,45(11):4490-4494.

[22] 李春,司伊康. 烯丙位氧化的幾種方法[J].有機(jī)化學(xué),2003,23(6):518-525.

[23] 陳玉彬. 烯丙位氧化反應(yīng)研究的某些進(jìn)展[J].沈陽藥學(xué)院學(xué)報(bào),1991,8(1):60-66.

[24] Iriarte J, Schaffner K, Jeger O. Photochemische reaktionen.22.Mitteilung.UV-bestrahlung von 11-oxo-steroiden Ⅲ.Zur beeinflussung der(11→19)-cyclisation durch sterische faktoren[J].Helv Chim Acta,1963,46(5):1599-1609.