許涓涓 杜 娟 唐 斌 李 萌 譚舒尹 黃萍麗

廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院 廣西壯族自治區(qū)兒童醫(yī)院，廣西南寧 530003

泰國(guó)缺失型α-地中海貧血1導(dǎo)致血紅蛋白H病的產(chǎn)前診斷

許涓涓 杜 娟▲唐 斌 李 萌 譚舒尹 黃萍麗

廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院 廣西壯族自治區(qū)兒童醫(yī)院，廣西南寧 530003

目的 探討泰國(guó)缺失型α-地中海貧血1（泰國(guó)缺失型）導(dǎo)致的血紅蛋白H?。℉b H?。┊a(chǎn)前診斷方法。 方法收集2010年6月～2011年12月間在廣西婦幼保健院優(yōu)生遺傳門(mén)診就診的3對(duì)可能生育泰國(guó)缺失型Hb H病胎兒夫婦，采用先后檢測(cè)常規(guī)6種常見(jiàn)α-地中海貧血（α-地貧）基因型和檢測(cè)泰國(guó)缺失型的方法，對(duì)這3對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。 結(jié)果3對(duì)夫婦產(chǎn)前診斷胎兒均為Hb H病，1例是泰國(guó)缺失型復(fù)合右側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α3.7）；1例是泰國(guó)缺失型復(fù)合左側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α4.2）；1例是泰國(guó)缺失型復(fù)合Hb Westmead雙重雜合子，基因型是（--THAI/αWSα）。 結(jié)論 綜合分析常規(guī)檢測(cè)和泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果，能有效的產(chǎn)前診斷泰國(guó)缺失型導(dǎo)致的Hb H病。

血紅蛋白H?。惶﹪?guó)缺失型；產(chǎn)前診斷

在東南亞地區(qū)和中國(guó)南方，α-地中海貧血 （α-地貧）是常見(jiàn)的遺傳性溶血性貧血，致病機(jī)制主要是位于16號(hào)染色體上的α-珠蛋白基因的缺失或缺陷導(dǎo)致α-珠蛋白鏈合成減少或不能合成。一條16號(hào)染色體上正常存在2個(gè)α-基因，如果同時(shí)缺失稱(chēng)為缺失型α地貧1（或稱(chēng)α0地貧），最常見(jiàn)的類(lèi)型是東南亞缺失型α地貧1（簡(jiǎn)稱(chēng)東南亞缺失型），而泰國(guó)缺失型α地貧1（簡(jiǎn)稱(chēng)泰國(guó)缺失型）罕見(jiàn)，兩者的比例大約是99∶1。泰國(guó)缺失型缺失了包括ζ珠蛋白基因和2個(gè)α珠蛋白基因在內(nèi)的33.5 kb的片段[1]，它的5'斷裂端距ζ珠蛋白基因起始密碼子上游約3 kb，3'斷裂端距α1珠蛋白基因起始密碼子下游約6.6 kb[2]。在國(guó)內(nèi)，泰國(guó)缺失型既往在臺(tái)灣、廣東、廣西及福建有散在發(fā)現(xiàn)[3-7]，它與其他α-地貧復(fù)合存在，在臨床上可以形成中重型α-地貧，即泰國(guó)缺失型的血紅蛋白H?。℉b H病）和泰國(guó)缺失型的巴氏水腫胎。Hb H病患者可出現(xiàn)輕、中度貧血、肝脾大、黃疸等輕重不一癥狀和體征，嚴(yán)重者需輸血、脾切除，影響身心健康，目前該病根治方法為干細(xì)胞移植。因此，為了提高人口素質(zhì)，降低出生缺陷，有生育Hb H病胎兒風(fēng)險(xiǎn)的夫婦需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷，阻斷Hb H病胎兒出生。

目前常規(guī)α-地貧基因診斷只包括常見(jiàn)的6種基因類(lèi)型，即 3 種缺失型[東南亞缺失型（--SEA/）、右側(cè)缺失型（-α3.7/）、 左側(cè)缺失型（-α4.2/）]和 3 種點(diǎn)突變[Hb constant spring（Hb CS）、Hb Westmead （Hb WS）和 Hb Quong Sze（Hb QS）]。泰國(guó)缺失型由于罕見(jiàn)而不在常規(guī)檢測(cè)范圍，因而造成漏診，導(dǎo)致泰國(guó)缺失型的Hb H病和泰國(guó)缺失型的巴氏水腫胎兒出生。如何避免泰國(guó)缺失型漏診，本研究筆者對(duì)發(fā)現(xiàn)3對(duì)有可能生育泰國(guó)缺失型Hb H病胎兒的夫婦，采用兩步驟的檢測(cè)方法成功進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，現(xiàn)報(bào)道如下，以期為相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年6 月～2011年12月在廣西婦幼保健院優(yōu)生遺傳門(mén)診就診的夫婦中發(fā)現(xiàn)3對(duì)可能生育泰國(guó)缺失型Hb H病胎兒，知情同意后，對(duì)其進(jìn)行地貧產(chǎn)前診斷。

1.2 取材

外周血樣本：抽取靜脈血 2 mL，EDTA抗凝，取 200 μL提取DNA。羊水樣本：按常規(guī)抽取10mL，3500r/min離心10min，棄上清液，取沉淀提取DNA。臍血樣本：按常規(guī)抽取1 mL，EDTA抗凝后，取其中200 μL用于提取DNA。外周血和臍帶血樣本同時(shí)進(jìn)行血常規(guī)和血紅蛋白檢測(cè)。血常規(guī)檢測(cè)采用全自動(dòng)血液分析儀（邁瑞公司BC-5800）。血紅蛋白檢測(cè)采用凝膠血紅蛋白電泳（全自動(dòng)電泳儀，法國(guó)Sebia公司），按說(shuō)明操作。

1.3 DNA提取

按微量DNA提取試劑盒 （德國(guó)QIAGEN公司）說(shuō)明提取。

1.4 6 種常見(jiàn)α-地貧基因型檢測(cè)

每份樣本首先進(jìn)行6種常見(jiàn)α-地貧基因型檢測(cè)。（--SEA/）、（-α3.7/）和（-α4.2/）檢測(cè)采用跨越斷裂點(diǎn) PCR（gap-PCR）方法；Hb CS、Hb WS和Hb QS檢測(cè)采用等位基因特異性寡核甘酸探針?lè)聪虬唿c(diǎn)雜交方法（RDB）進(jìn)行 （α-地貧檢測(cè)試劑盒，深圳創(chuàng)益生物有限公司），操作均按說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 泰國(guó)缺失型檢測(cè)

每份樣本取2 μL DNA，采用gap-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，引物見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為1 000 bp。50 μL 反應(yīng)體系包括：10×緩沖液、2 mmol/L dNTPs、Tap DNA聚合酶 0.5 μL （大連寶生物）、10 nmol/L 引物，DNA 1μg；反應(yīng)條件：預(yù)變性 96℃ 5 min，98℃ 45 s，61℃ 90 s，72℃ 135 s，循環(huán) 35 次，72℃ 5 min；在 PCR 儀（ABI，9700）上反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL在1%瓊脂糖凝膠上電泳50 min，Y啶橙核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad，DOC-XR）上觀察，并照相保存。

2 結(jié)果

2.1 家系1

2.1.1 妻子36歲，廣西平果人，壯族，血常規(guī)和血紅蛋白電泳未見(jiàn)異常；常見(jiàn)α-地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為右側(cè)缺失型雜合子，泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果為未檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，基因型是（-α3.7/αα）。

2.1.2 丈夫37歲，廣西平果人，壯族，無(wú)貧血外貌，肝脾腫大

不明顯，血常規(guī)結(jié)果：平均紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）下降，提示小細(xì)胞低色素貧血；血紅蛋白電泳Hb A22.0%，Hb H 5%；常見(jiàn)α-地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為左側(cè)缺失型純合子，泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果為檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，丈夫?qū)嶋H為泰國(guó)缺失型復(fù)合左側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α4.2）。

2.1.3 胎兒胎齡22周，系統(tǒng)B超未見(jiàn)異常，臍血血常規(guī)結(jié)果為：血紅蛋白 93 g/L，MCV 87.5 fl，MCH 26.5 pg，均較正常下降；臍血血紅蛋白分析結(jié)果為檢出Hb bart's帶，含量21.4%，提示胎兒為Hb H?。怀Ｒ?jiàn)α地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為右側(cè)缺失型純合子；泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果為檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，胎兒實(shí)際地貧基因?yàn)樘﹪?guó)缺失型復(fù)合右側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α3.7）。家系1的血常規(guī)、血紅蛋白電泳和基因分析結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.2 家系2

2.2.1 妻子36歲，廣西欽州人，漢族，血常規(guī)和血紅蛋白電泳未見(jiàn)異常；常見(jiàn)α地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為左側(cè)缺失型雜合子；泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果為未檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，基因型是（-α4.2/αα）。

2.2.2 丈夫45歲，廣西大化人，壯族，血常規(guī)結(jié)果：MCV、MCH下降，提示小細(xì)胞低色素貧血；血紅蛋白電泳Hb A22.8%；常見(jiàn)α-地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為6種基因型檢測(cè)均未檢出；泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果為檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，丈夫?qū)嶋H為泰國(guó)缺失型雜合子，基因型是（--THAI/αα）。

2.2.3 胎兒現(xiàn)在孕16周，B超未見(jiàn)異常；常見(jiàn)α-地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為左側(cè)缺失型純合子；泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果為檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，胎兒實(shí)際地貧基因?yàn)樘﹪?guó)缺失型復(fù)合左側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α4.2）。家系2的血常規(guī)、血紅蛋白電泳和基因分析結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.3 家系3

2.3.1 妻子36歲，廣西南寧人，壯族，血常規(guī)和血紅蛋白電泳未見(jiàn)異常；常見(jiàn)α地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為是Hb WS雜合子；泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果是未檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，基因型是（αWSα/αα）。

2.3.2 丈夫36歲，廣西南寧人，漢族，血常規(guī)結(jié)果：MCV、MCH下降，提示小細(xì)胞低色素貧血；血紅蛋白電泳Hb A23.1%；常見(jiàn)α-地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為6種基因型檢測(cè)均未檢出；泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果為檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，丈夫?qū)嶋H為泰國(guó)缺失型雜合子，基因型是（--THAI/αα）。

表1 3個(gè)家系臨床表型和基因分析

2.3.3 胎兒現(xiàn)在胎齡18周，B超未見(jiàn)異常；常見(jiàn)α-地貧6種基因型檢測(cè)結(jié)果為Hb WS純合子；泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果檢出泰國(guó)缺失型。將兩者結(jié)合分析，胎兒實(shí)際地貧基因?yàn)樘﹪?guó)缺失型復(fù)合 Hb WS 雙重雜合子，基因型是（--THAI/αWSα）。 家系3的血常規(guī)、血紅蛋白電泳和基因分析結(jié)果詳見(jiàn)表1。

3 討論

利用引物或探針設(shè)計(jì)位點(diǎn)的相互關(guān)系分析常規(guī)檢測(cè)和泰國(guó)缺失型檢測(cè)結(jié)果，可有效對(duì)泰國(guó)缺失型導(dǎo)致的Hb H病胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，即分別檢測(cè)常見(jiàn)α-地貧6種基因型和泰國(guó)缺失型，將二者結(jié)果綜合分析，得出最終的基因型。以本研究家系2中的胎兒為例，常見(jiàn)α地貧3種缺失型基因型檢測(cè)結(jié)果只有左側(cè)缺失型片段產(chǎn)物，沒(méi)有東南亞缺失型、右側(cè)缺失型或α2珠蛋白基因片段產(chǎn)物，提示該患者除存在左側(cè)缺失型之外，還存在有缺失范圍起碼包括α2珠蛋白基因的未知的大片段α-地貧缺失類(lèi)型；3種常見(jiàn)α-地貧點(diǎn)突變檢測(cè)結(jié)果為Hb CS、Hb WS和 Hb QS野生型和突變型型探針均未檢出，突變型探針未檢出固然提示沒(méi)有Hb CS或Hb WS或Hb QS突變，而野生型探針未檢出提示這些突變位點(diǎn)所在基因片段均缺失 （Hb CS、Hb WS和 Hb QS突變位點(diǎn)較為鄰近，而且都位于α2珠蛋白基因的3'端）；而已知左側(cè)缺失型的缺失范圍是包括上述突變位點(diǎn)所在基因片段的，也就是說(shuō)，3種常見(jiàn)α-地貧點(diǎn)突變檢測(cè)結(jié)果提示該患者除存在左側(cè)缺失型之外，還存在未知的缺失范圍起碼包括上述突變位點(diǎn)所在基因片段α-地貧缺失類(lèi)型。泰國(guó)缺失型檢測(cè)證實(shí)胎兒存在泰國(guó)缺失型，而它的缺失范圍包括了整個(gè)α2珠蛋白基因，即該結(jié)果證實(shí)了前兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果。綜合上述3種不同的基因診斷方法結(jié)果，得出家系2中的胎兒的基因型為泰國(guó)缺失型復(fù)合左側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α4.2）。

本實(shí)驗(yàn)提示，在地貧的高發(fā)區(qū)，常規(guī)α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果提示未檢出異常基因或檢出α+地貧純合子的患者有誤診的可能。這樣的患者與α0地貧攜帶者或α+地貧攜帶者婚配，仍有生育Hb H病或Hb Bart's水腫胎的可能。廣西是貧血高發(fā)區(qū)，α-地貧發(fā)生率達(dá)15.5%，常規(guī)α-地貧基因檢測(cè)突變類(lèi)型有限，對(duì)于臨床表現(xiàn)提示地貧，而與基因檢測(cè)結(jié)果不符的，注意檢測(cè)少見(jiàn)地貧類(lèi)型。單從本實(shí)驗(yàn)中3對(duì)夫婦的常規(guī)α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，并無(wú)生育Hb H患兒的可能，但是通過(guò)結(jié)合臨床資料，推測(cè)3位丈夫可能存在少見(jiàn)的α0地貧類(lèi)型，而實(shí)驗(yàn)最終證實(shí)了筆者的判斷。本研究檢測(cè)出3對(duì)夫婦胎兒均是Hb H病兒，其中，1例是泰國(guó)缺失型復(fù)合右側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α3.7）；另1例是泰國(guó)缺失型復(fù)合左側(cè)缺失型雙重雜合子，基因型是（--THAI/-α4.2）；最后1例是泰國(guó)缺失型復(fù)合Hb WS雙重雜合子，基因型是（--THAI/αWSα）。筆者及時(shí)通知了這3對(duì)夫婦，并分別進(jìn)行了遺傳咨詢(xún)，讓他們知曉胎兒可能出現(xiàn)輕到中度的貧血，有助于優(yōu)生優(yōu)育、降低出生缺陷和提高人口素質(zhì)。

有趣的是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)家系1的丈夫也是（--THAI/-α4.2）患者，患有輕度貧血癥狀（Hb 113 g/L），肝脾腫大不明顯，無(wú)地貧外貌，無(wú)輸血史。這提示泰國(guó)缺失型的Hb H病可能與其他缺失型Hb H癥狀相似。有報(bào)道認(rèn)為，泰國(guó)缺失型復(fù)合Hb CS雙重雜合子臨床癥狀比其他缺失型Hb H病嚴(yán)重[8]，在臨床咨詢(xún)中值得注意。

當(dāng)然，在中國(guó)人群中，α0地貧的類(lèi)型除上述的東南亞缺失型和泰國(guó)缺失型外，還有菲律賓缺失型（Filipino deletion，--FIL/）[9]。以往的報(bào)道在臺(tái)灣人群中檢出菲律賓缺失型，而且認(rèn)為該地區(qū)菲律賓缺失型比泰國(guó)缺失型常見(jiàn)[3]。本研究筆者對(duì)這3對(duì)夫婦也進(jìn)行了菲律賓缺失型檢測(cè)，結(jié)果并未檢出。這一定程度上提示，在國(guó)內(nèi)泰國(guó)缺失型比菲律賓缺失型更常見(jiàn)。當(dāng)然，如果泰國(guó)缺失型未檢出，還要進(jìn)一步檢測(cè)菲律賓缺失型等其他α0地貧的類(lèi)型。

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Prenatal diagnosis of hemoglobin H disease caused by Thailand deletion of α-thalassemia 1

XU Juanjuan DU Juan▲TANG Bin LI Meng TAN Shuyin HUANG Pingli
Maternity and Child Care Center of Guangxi Zhuang Autonomous Region Children's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530003,China

ObjectiveTo explore the prenatal diagnosis method of hemoglobin H disease (Hb H disease)caused by Thailand deletion of α-thalassemia 1.Methods3 couples who might have fetuses with Hb H disease caused by Thailand deletion of α-thalassemia 1 in eugenic and genetic outpatients clinic of Guangxi Zhuang Autonomous Region maternal and child care center from June 2010 to December 2011 were chosen.Genotypes of six kinds of common alpha-thalassemia(alpha-poor)and Thailand deletion of α-thalassemia 1 were detected.Then prenatal diagnoses were carried out for these three high-risk couples.ResultsPrenatal diagnosis of fetuses in the three couples were Hb H disease.One case was double heterozygous of Thailand deletion of α-thalassemia 1 and right side deletion,and its genotype was(--THAI/-α3.7).One case was double heterozygous of Thailand deletion of α-thalassemia 1 and left side deletion,and its genotype was(--THAI/-α4.2).One case was double heterozygous of Thailand deletion of α-thalassemia 1 and Hb Westmead,and its genotype was(--THAI/αWSα).ConclusionComprehensive analysis of test results of conventional detection and Thailand deletion of α-thalassemia 1 detection can make effective prenatal diagnosis for Hb H disease caused by Thailand deletion of α-thalassemia 1.

Hb H disease;Thailand deletion;Prenatal diagnosis

R556.61

A

1673-7210（2012）08（c）-0059-03

▲通訊作者

2012-05-15 本文編輯：程 銘）