王旭云 楊 柳 何曉晶 來文婷 曾文華 張 佼

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062

茉莉酸甲酯對貫葉連翹中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素含量的影響

王旭云 楊 柳 何曉晶 來文婷 曾文華 張 佼

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062

目的刺激貫葉連翹次生代謝產(chǎn)物的迅速積累，提高有效成分含量。 方法采用高效液相色譜法以Phenomenex硅膠基質(zhì)C18色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）為色譜柱，甲醇和0.2%乙酸水溶液為流動相，檢測波長為270 nm，進樣量為20 μL來測定茉莉酸甲酯（5 mmol/L）處理后的貫葉連翹次生代謝產(chǎn)物的含量。 結(jié)果 在短時間的茉莉酸甲酯的處理下，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素的含量在整體上有一定的提高。 結(jié)論 若加長茉莉酸甲酯的處理時間，這些次生代謝產(chǎn)物的含量變化將更加顯著。

貫葉連翹；次生代謝物；茉莉酸甲酯；高效液相色譜法

貫葉連翹（Hypericum perforatum L.）為藤黃科（Garcinia）金絲桃屬多年生草本植物，全草入藥。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為，貫葉連翹具有清熱解毒、收斂止血、利濕之功效，現(xiàn)代臨床治療中主要用于止血、抗炎、婦科病等方面的治療[1]。其主要的活性成分分為三種類型：萘駢二蒽酮類（naphtodianthrones）化合物、間苯三酚類（phloroglucinols）化合物、黃酮類（flavonoids）化合物。本試驗主要研究貫葉連翹中的酚類化合物金絲桃素和黃酮類化合物槲皮素、蘆丁、槲皮苷。已有試驗證明，金絲桃素的消炎止痛效果與標(biāo)準(zhǔn)的消炎止痛藥阿斯匹林效果相當(dāng)，金絲桃素的吸收可以減少酒精攝入量，對神經(jīng)行為有影響。而且金絲桃素具有突出的抗DNA和RNA病毒的抗病毒活性。此外，金絲桃素也是一種有前途的內(nèi)源性光敏劑，可用于腫瘤的光化學(xué)診斷和治療。蘆丁臨床用于預(yù)防中風(fēng)、高血壓、眼底出血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、急性出血性腎炎等。槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、心血管保護等作用，并發(fā)現(xiàn)其新的藥理作用，如抗抑郁癥等[2]。

本試驗利用茉莉酸甲酯（MeJA）能夠誘導(dǎo)植物體啟動內(nèi)在防御機制的特性，對貫葉連翹進行噴施，刺激其次生代謝產(chǎn)物的迅速積累，提高有效成分含量，并采用高效液相色譜法測定蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素的含量，旨在提高貫葉連翹有效成分含量，為進一步從基因水平上研究茉莉酸甲酯對貫葉連翹的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2011年9月在教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點試驗室科研溫室中進行。貫葉連翹種子購自陜西天士力植物藥業(yè)商洛有限公司商州藥源基地。

播種貫葉連翹種子，待其長出第一對真葉時，將幼苗每三株一組移栽至營養(yǎng)缽中，隨機將三個營養(yǎng)缽分為一組，重復(fù)處理3次。在光周期為16 h/8 h（晝/夜）、光照強度為2 000 lx、溫度為（25±2）℃、濕度為 60%～80%、植株每 2 天澆水1次的條件下培養(yǎng)。

1.2 茉莉酸甲酯的處理

1.2.1 5 mmol MeJA溶液的配制 MeJA溶于2%（V/V）的乙醇水溶液中，由于MeJA微溶于水，配制時準(zhǔn)備一定量的無水乙醇溶解MeJA，必要時可采用超聲波促溶，再加H2O定容。對照溶液為2%（V/V）的乙醇水溶液。

1.2.2 MeJA處理組 培養(yǎng)至60 d時，選取生長狀況良好、長勢一致的貫葉連翹植株進行葉面噴施，處理濃度為5 mmol MeJA溶液。試驗處理開始于上午8∶00，每棵植株約噴灑適量MeJA溶液，以控制溶液均勻覆蓋所有葉片。由于MeJA易揮發(fā)，噴施后應(yīng)立即蒙上保鮮袋，放入培養(yǎng)箱中。噴施處理后于0、1、2、4、6、8、10 h 取樣，清洗，液氮保存后放入-80℃冰箱中保存待用。

1.2.3 對照組 以上述處理組對應(yīng)條件下的2%（V/V）的乙醇水溶液處理作為對照組，處理及材料收集方法同上。注意在處理過程中處理植株與對照植株要完全隔離，以避免飄逸的MeJA影響試驗結(jié)果。

1.3 樣品的制備及色譜條件

將待測樣品于液氮下研磨，稱取20 mg于1.5 mL離心管中。加入1 mL 80%的甲醇，超聲提取40 min，然后5 500×g離心3 min，取上清液，最后用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液即為待測樣品溶液。

色譜條件為固定相采用Phenomenex硅膠基質(zhì)C18色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）。流動相參考 Raffaella 等[3]的方法，略作修改。波長參考唐靜等[4]結(jié)果，確定最佳檢測波長為270 nm。流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；進樣量：20 μL；流動相：A為乙腈，B為甲醇，C為0.2%乙酸水。梯度模式見表1。

表1 流動相梯度模式（體積分?jǐn)?shù)，%）

2 結(jié)果

MeJA處理結(jié)果見圖1。由圖1各成分含量的變化可以看出，在0～4 h內(nèi)試驗組植株的金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷和槲皮素含量都在上升，且均明顯高于對照組，4～6 h內(nèi)蘆丁、槲皮苷和槲皮素含量也高于對照組，且蘆丁和金絲桃苷的含量達到最大值。在6 h之后試驗組各成分的含量略低于對照。這表明茉莉酸甲酯的處理確實在一個短時間內(nèi)能夠誘導(dǎo)貫葉連翹啟動內(nèi)在防御機制，有效刺激其次生代謝產(chǎn)物的迅速積累。

2.1 精密度考察

取同一份樣品，按照相同的色譜條件，分別在0、4、8、10、16、24 h進樣6次，計算樣品中主要色譜峰保留時間和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示各時間段主要色譜峰保留時間一致，且RSD均小于3.5%，表明HPLC儀器的精密度良好。

2.2 重復(fù)性試驗

取同一份貫葉連翹樣品，相同的方法處理成5份，比較5次重復(fù)主要色譜峰保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正，5次重復(fù)主要色譜峰保留時間RSD均小于2.0%，峰面積RSD均小于3.5%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

圖1 茉莉酸甲酯處理貫葉連翹后蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素含量的變化

取同一份樣品，按照相同的色譜條件，分別在0、4、8、16 h，24 h進樣，考察其穩(wěn)定性。大部分色譜峰的保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在16 h內(nèi)均小于5%，在24 h內(nèi)RSD小于10%，當(dāng)樣品放置24 h后，大部分代謝產(chǎn)物的衍生物逐漸不穩(wěn)定，RSD超過了15%，因此樣品應(yīng)保證在16 h內(nèi)測完。

2.4 HPLC含量測定試驗

按照“1.3”項下色譜條件，檢測試驗組和對照組中各成分的含量，結(jié)果見表2。

2.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品50 mg，共6份。每份分別準(zhǔn)確加入金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品母液10 μL，按照相同的色譜條件進樣分析，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測得金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷和槲皮素的加樣回收率（n=6）分別為 95.4%、96.2%、98.3%、101.2%、95.9%和 99.2%，峰面積RSD均小于3.5%，表明此方法的準(zhǔn)確性較高。

3 討論

目前貫葉連翹在國外研究較多，而國內(nèi)研究甚少[5]。但是貫葉連翹具有很長的藥用歷史，根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，其性平，貫葉連翹味辛苦澀，具有清心明目、舒經(jīng)活血、止血生肌、解毒消炎、利濕之功效[6]。近年來，在歐洲和美國，大量使用從貫葉連翹中提取的物質(zhì)制成制劑，用來治療抑郁癥。相關(guān)文獻[7]還報道貫葉連翹具有抗腫瘤的活性。隨著醫(yī)藥需求日益增長，提高貫葉連翹有效成分含量，培育優(yōu)質(zhì)新品種已經(jīng)成為貫葉連翹資源開發(fā)必須解決的關(guān)鍵問題之一。

表2 50 mg貫葉連翹植株對照組和試驗組中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素含量（mg）

茉莉酸及其衍生物MeJA是一類新型的植物激素和信號分子，其廣泛存在于高等植物體內(nèi)，作為植物應(yīng)對逆境脅迫和植物不同發(fā)育階段的共同信號分子，可以激活細胞的防御反應(yīng)，并誘導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)揮重要作用。研究表明外源噴施MeJA具有一定的逆境脅迫和調(diào)節(jié)效應(yīng)，能夠誘導(dǎo)植物體啟動內(nèi)在防御機制，有效刺激植物次生代謝產(chǎn)物的迅速積累[8]。這種有效調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，提高植物性狀和質(zhì)量的策略有效監(jiān)管和控制，愈來愈受到人們的關(guān)注。

試驗利用茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)植物體啟動內(nèi)在防御機制的特性，對貫葉連翹作出處理。結(jié)果表明，適量噴灑低濃度MeJA激素可促使貫葉連翹次生代謝物質(zhì)的合成，外源MeJA能在短時間內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)，影響貫葉連翹中酚酸類和黃酮類各成分的含量。隨著處理時間的延長，各次生代謝產(chǎn)物的含量均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。在0～6 h內(nèi)，經(jīng)MeJA誘導(dǎo)，各類次生代謝產(chǎn)物的含量均高于對照。隨后貫葉連翹葉片表面出現(xiàn)萎蔫狀態(tài)，在6～10 h內(nèi)，各次生代謝產(chǎn)物的含量略低于對照，可能由于MeJA處理啟動了植物體的抗逆機制，使更多的代謝中間產(chǎn)物趨于次生代謝產(chǎn)物的合成，從而間接影響了地上部分的初生代謝和正常生長。

綜上所述，本方法用茉莉酸甲酯處理貫葉連翹可以在一定程度上提高貫葉連翹次生代謝物的產(chǎn)量，方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于在基因水平上探究貫葉連翹酚酸類合成的機制。

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Influence of Jasmonic Acid Methyl ester on the contents of rutin,hyperin,quercitrin and quercetin from Hypericum perforatum L.

WANG Xuyun YANG Liu HE XiaojingLAI WentingZENG WenhuaZHANG Jiao Life Science Faculty of Shaanxi Normal University,Shaanxi Province,Xi'an 710062,China

ObjectiveTo stimulate accumulation of secondary metabolites of Hypericum perforatum L.rapidly and improve the content of effective components.MethodsThe high performance liquid chromatography,with Phenomenex silica-based C18column(5 μm×4.6 mm×250 mm)was used as column,methanol and 0.2%acetic acid aqueous solution were used as mobile phase,270 nm was used as detection wavelength,20 μL was used as sample size to measure the content of sec ondary metabolites of Hypericum perforatum L.after treatment with Jasmonic Acid Methyl ester(MeJA).ResultsIn the short time of the MeJA treatment,the contents of rutin,hyperin,quercitrin and quercetin had a certain improvement on the whole.ConclusionIf extended MeJA treatment time,these changes in secondary metabolites content will be more pronounced.

Hypericum perforatum L.;Secondary metabolites;Jasmonic Acid Methyl ester;High performance liquid chromatography

R284.1

A

1673-7210（2012）08（c）-0115-03

王旭云（1991-），女，湖北黃岡人，2009級生物科學(xué)專業(yè)在讀本科生。

2012-04-19 本文編輯：衛(wèi) 軻）