賈翠英,張玉輝,馬曉況

(河南科技學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

自1945年Johnson等報(bào)道枯草芽孢桿菌產(chǎn)生拮抗物質(zhì)以來(lái),人們已從枯草芽孢桿菌的不同菌株中分離出幾十種抗菌物質(zhì),并弄清了這些抗菌物質(zhì)是一類(lèi)從簡(jiǎn)單分子到復(fù)雜化合物即從桿菌肽(bacitracin)[1],大環(huán)脂(eyeleopetite)[2-3],到類(lèi)似噬菌體顆粒等[4]不同成分組成的物質(zhì),此外,其中一部分是低分子量的抗菌素,也有一些蛋白性的抗菌物質(zhì)[5].目前研究較多的拮抗物質(zhì)是細(xì)菌素和抗生素以及細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物.

1954年,Abo-El-Dahabll[6]發(fā)現(xiàn)青枯菌間有拮抗作用,有些菌株具有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力,后來(lái)Cupples[7]對(duì)這種物質(zhì)進(jìn)行分析,證明它是含蛋白質(zhì)的細(xì)菌素(Bactericin).1979年,Echandi[8]深入研究細(xì)菌素的特性,認(rèn)為carotovoricin和chrysonothemicin為蛋白質(zhì)大分子細(xì)菌素.王金生等[9]從來(lái)自水稻的菊歐氏桿菌(E.chrysanthemi)分離提取一種細(xì)菌素,通過(guò)試驗(yàn)研究證明,細(xì)菌素是一種細(xì)菌產(chǎn)生的對(duì)不同細(xì)菌系或親緣種的細(xì)菌有拮抗作用的抗菌物質(zhì),其成分主要為蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸、生物堿類(lèi).任欣正等[10]從青枯假單胞桿菌(Pseudomonassolanacearum)菌株提純出具有生物活性的細(xì)菌素,分子量為19 ku,具有蛋白質(zhì)性質(zhì),含16種氨基酸.目前產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌主要種類(lèi)有:土壤放射桿菌(A.radiobacter)、丁香假單胞菌(P.syringae)、密執(zhí)安棒形桿菌(Clavibactermichiganesis)、菊歐氏桿菌(E.chrysanthemi)、甘藍(lán)黑腐黃單胞菌(Xanthomonascampestris).這些產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌進(jìn)行生防時(shí),可以直接用于大田防治,如對(duì)細(xì)菌性冠癭病和青枯病的防治[11].據(jù)研究報(bào)道,細(xì)菌素的主要作用是抑菌而不是溶菌作用或殺菌.

拮抗細(xì)菌的抑菌機(jī)制主要有4種.1.拮抗作用:拮抗細(xì)菌的同化作用產(chǎn)生能抑制病原菌的抗菌物質(zhì),一般在低濃度下就能對(duì)病原菌的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生抑制,引起細(xì)胞內(nèi)溶現(xiàn)象[12].2.競(jìng)爭(zhēng)作用:就是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)、物理位點(diǎn)、生態(tài)位點(diǎn)的搶占以及氧氣的競(jìng)爭(zhēng).3.寄生作用:就是侵入到病原菌體內(nèi)獲得營(yíng)養(yǎng)籍以生存和發(fā)展,常以吸附生長(zhǎng)、纏繞、侵入、消解等多種形式抑制病原菌.4.誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR):就是采用非親和性的病原物或其他因素誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性.植物因誘導(dǎo)所激發(fā)的系統(tǒng)抗性與植物所產(chǎn)生的抵抗挑戰(zhàn)菌的代謝產(chǎn)物有關(guān).國(guó)外,利用無(wú)毒青枯菌突變體處理番茄幼苗和馬鈴薯塊莖表現(xiàn)一定程度的抗病性[13],研究認(rèn)為青枯菌細(xì)胞壁表層脂多糖中的脂質(zhì)是引起保衛(wèi)反應(yīng)的誘導(dǎo)體.大量研究結(jié)果表明[14-15],拮抗細(xì)菌的抑菌結(jié)果主要造成病原菌畸形、產(chǎn)生泡狀物、破壞病原菌的細(xì)胞壁、引起細(xì)胞內(nèi)含物外溢,有的造成菌絲扭曲、原生質(zhì)凝聚、生長(zhǎng)點(diǎn)膨大、細(xì)胞壁破裂、菌絲崩潰,對(duì)孢子萌發(fā)有一定抑制作用.

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)一株拮抗細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的一些理化性質(zhì)的研究分析并進(jìn)一步對(duì)拮抗物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，為進(jìn)一步提高拮抗細(xì)菌拮抗性能提供一定參考數(shù)據(jù),同時(shí)也為拮抗細(xì)菌更好地應(yīng)用提供必要的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料拮抗細(xì)菌(Enterobactersp.)由河南科技學(xué)院分離工程教研室提供;指示菌為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、炭疽桿菌，由河南科技學(xué)院微生物教研室提供.

1.2試劑莫式試劑[16]:稱取α-萘酚5 g,溶于95%乙醇并稀釋至100 mL.此試劑需新鮮配制,并儲(chǔ)于棕色試劑瓶中.菲林試劑[16](臨時(shí)用時(shí)將試劑A和B等體積混合)，試劑A:稱取硫酸銅34.5 g,溶于蒸餾水并稀釋至500 mL;試劑B:稱取氫氧化鈉125 g,酒石酸鉀鈉137 g,溶于蒸餾水并稀釋至500 mL.0.1%茚三酮溶液[16]:稱取0.1 g茚三酮溶液溶于95%乙醇并稀釋至100 mL.pH 8.0磷酸緩沖液:將0.2 mol/L磷酸氫二鈉94.5 mL和0.2 mol/L磷酸二氫鈉5.3 mL混勻.

1.3儀器回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜:型號(hào)YPN-I(上海通特電訊設(shè)備廠);電熱式蒸汽消毒器:型號(hào)Q602(山東新華醫(yī)療儀器廠);單人雙面凈化工作臺(tái):型號(hào)SW-CJ-1F(蘇州凈化設(shè)備有限公司);電子天平:型號(hào)JA5002(上海精天電子儀器有限公司);臺(tái)式離心機(jī):型號(hào)TD2-40B(上海安亭科學(xué)儀器廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:型號(hào)PYX-DHS-50X65-B5(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);電熱恒溫水浴鍋:型號(hào)HH.SY21-Ni(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱:型號(hào)101-2(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);快速混勻器:型號(hào)SK-1(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠).

1.4 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)

1.4.1 菌種活化 將4 ℃冰箱內(nèi)保存的拮抗細(xì)菌(Enterobactersp.)和指示菌:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、炭疽桿菌分別轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基(組成為牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L, 葡萄糖10 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂18 g/L, pH 7.2),28 ℃培養(yǎng)24 h,備用.

1.4.2 種子液的制備和指示菌的培養(yǎng) 拮抗菌種子液的制備:取2～3 環(huán)活化的拮抗細(xì)菌菌種, 接入內(nèi)盛50 mL 種子培養(yǎng)基(淀粉3 g/L,蛋白胨12 g/L,無(wú)水氯化鈣3 g/L, pH 8.0)的250 mL 三角瓶中, 28 ℃,160 r/min 培養(yǎng)24 h.指示菌的培養(yǎng):取2～3 環(huán)活化的菌種, 接入內(nèi)盛100 mL 種子培養(yǎng)基(牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L, 葡萄糖10 g/L,氯化鈉5 g/L, pH 7.2)的250 mL 三角瓶中,28 ℃,160 r/min 培養(yǎng)24 h,備用.

1.4.3 拮抗菌的發(fā)酵培養(yǎng) 取4 mL拮抗菌種子液,移入內(nèi)盛50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中(接種量為8%,體積分?jǐn)?shù)),置于搖床上,28 ℃,160 r/min 培養(yǎng)36 h.

1.5抑菌活性的測(cè)定方法待滅完菌的的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時(shí)倒平板,冷卻至凝固,用移液槍取200 μL指示菌菌懸液于平板上,用涂布棒涂勻.然后用內(nèi)徑為8 mm 的打孔器在平板上打孔,用移液槍吸取150 μL 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液注入孔內(nèi), 于28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,用十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小,抑菌圈直徑越大表示抑菌活性越大[17-18].

1.6 抑菌物質(zhì)的分離與抑菌活性檢測(cè)

1.6.1 硫酸銨沉淀法 取拮抗細(xì)菌抑菌物質(zhì)的粗提液(即拮抗菌發(fā)酵液經(jīng)3 500 r/min離心去菌體的上清液)1 mL分別進(jìn)行硫酸銨飽和度為40%、50%、60%、70%、80%的沉淀,4 ℃靜止過(guò)夜,以硫酸銨飽和度達(dá)到80%的空白培養(yǎng)液作為對(duì)照.12 000 r/min,4 ℃下離心20 min,分別收集上清和沉淀,并將沉淀溶于pH 8.0, 0.2 mol/L磷酸緩沖液中[19].按照1.5的方法分別測(cè)定上清和沉淀的抑菌活性大小.

1.6.2 低溫乙醇沉淀法 無(wú)水乙醇置于冰箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)冷處理.在抑菌物質(zhì)上清液中緩慢加入乙醇使其在溶液中的終濃度分別達(dá)到40%,50%,60%,70%,80%,此反應(yīng)在冰浴中進(jìn)行.于4 ℃下靜置過(guò)夜, 以含80%乙醇的空白培養(yǎng)液為對(duì)照.12 000 r/min, 4 ℃下離心20 min,分別收集上清和沉淀,將沉淀溶于pH 8.0, 0.2 mol/L磷酸緩沖液中[19].按照1.5的方法分別測(cè)定上清和沉淀的抑菌活性大小.

1.7 抑菌物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)分析

1.7.1 茚三酮反應(yīng) 取拮抗細(xì)菌抑菌物質(zhì)的粗提液1 mL置于試管中,加2滴茚三酮試劑,加熱至沸(此反應(yīng)必須在pH 5～7進(jìn)行)[16],觀察顏色變化,以蒸餾水為對(duì)照.

1.7.2 雙縮脲反應(yīng) 取2支試管,分別加拮抗菌抑菌物質(zhì)的粗提液1 mL和蛋白胨水溶液1 mL,再加入10%氫氧化鈉溶液10滴及1%硫酸銅溶液2滴,混勻,觀察是否有紫玫瑰色出現(xiàn)[16].以蒸餾水為對(duì)照.

1.7.3 莫氏實(shí)驗(yàn) 取5支試管,分別加1 mL 1%葡萄糖溶液,1%淀粉溶液,少許纖維素(棉花浸在1 mL水中),抑菌物質(zhì)的粗提液,無(wú)水乙醇沉淀物,然后分別加入莫氏試劑2滴,搖勻,將試管傾斜,沿管壁慢慢加入濃硫酸1.5 mL,硫酸層沉于試管底部與糖液分成兩層,觀察液面交界處有無(wú)紫紅色環(huán)出現(xiàn)[16][注意:莫氏試劑應(yīng)直接滴入試液中,勿使試劑接觸試管壁,否則試劑會(huì)與硫酸接觸生成綠色而掩蓋紫色環(huán)].

1.7.4 糖的還原反應(yīng) 于3支試管中加入菲林試劑A和B各1 mL,混勻,分別加入抑菌物質(zhì)的粗提液,1%葡萄糖溶液,1%淀粉溶液1 mL,置沸水浴中加熱數(shù)分鐘,取出,冷卻,觀察各管的顏色變化[16].

2 結(jié)果與分析

2.1抑菌活性的測(cè)定采用1.5的抑菌活性測(cè)定方法,對(duì)5種指示菌的抑菌效果測(cè)定如表1.由表中數(shù)據(jù)可知,該拮抗細(xì)菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑菌作用,說(shuō)明這株菌具有廣譜抗菌性.圖1～5分別顯示的是該拮抗細(xì)菌對(duì)大腸桿菌、炭疽桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果.此外,由表1還可知,該拮抗細(xì)菌對(duì)大腸桿菌抑菌作用最強(qiáng),因此,以下的實(shí)驗(yàn)均以大腸桿菌作為指示菌.

表1 抑菌活性測(cè)定結(jié)果

圖1 拮抗細(xì)菌對(duì)大腸桿菌抑菌效果

圖2 拮抗細(xì)菌對(duì)炭疽桿菌抑菌效果

圖3 拮抗細(xì)菌對(duì)地衣芽孢桿菌抑菌效果

圖4 拮抗細(xì)菌對(duì)蘇云金芽孢桿菌抑菌效果

圖5 拮抗細(xì)菌對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果

2.2 抑菌物質(zhì)的初步分離

2.2.1 硫酸銨沉淀法 拮抗細(xì)菌經(jīng)不同濃度硫酸銨沉淀后,發(fā)現(xiàn)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在70%時(shí)離心后沉淀物抑菌圈最大即抑菌活性最大(如表2、圖6),進(jìn)而可以初步推斷該拮抗物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì).此外,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%離心后的上清液均沒(méi)有抑菌圈,但離心后的沉淀均有抑菌圈,且根據(jù)抑菌圈大小,建議以70%為最適沉淀濃度.

2.2.2 低溫乙醇沉淀 利用不同濃度的乙醇處理抑菌物質(zhì)的粗提液,結(jié)果顯示不同乙醇濃度處理后的離心上清液都有明顯的抑菌圈(表3、圖7),而離心后的沉淀物都沒(méi)有抑菌圈,表明其沒(méi)有抑菌活性,同時(shí)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明低溫乙醇沉淀法不適于提取這種抑菌物質(zhì).

表2硫酸銨沉淀物與上清液的抑菌結(jié)果

硫酸銨濃度抑菌圈直徑/cm平均值/cm40%1.351.351.171.2950%1.451.271.471.3960%1.451.431.421.4370%1.451.571.351.4680%1.401.421.451.42硫酸銨沉淀離心后的上清液 ----除菌體后的發(fā)酵液1.351.351.401.36

表3不同濃度乙醇沉淀后上清液抑菌結(jié)果

乙醇濃度抑菌圈直徑/cm平均值/cm40%1.601.721.701.6750%1.801.901.851.8560%1.921.701.811.8170%1.701.651.601.6580%1.501.551.451.50乙醇處理、離心后的沉淀物----除菌體后的發(fā)酵液1.751.851.801.80

圖6 不同濃度硫酸銨沉淀物的抑菌活性

圖7 乙醇沉淀后離心上清液的抑菌活性

2.3 生理生化反應(yīng)結(jié)果

2.3.1 茚三酮反應(yīng) 拮抗菌抑菌物質(zhì)的粗提液茚三酮反應(yīng)成陽(yáng)性即有藍(lán)紫色出現(xiàn)(圖8)，表明粗提液里含有游離α-氨基的蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì).

2.3.2 雙縮脲反應(yīng) 拮抗菌抑菌物質(zhì)的粗提液的雙縮脲反應(yīng)為陽(yáng)性,溶液出現(xiàn)紫玫瑰色(圖9).這表明拮抗菌抑菌物質(zhì)的粗提液中含有蛋白質(zhì)或多肽.結(jié)合上述茚三酮反應(yīng)可推斷抑菌物質(zhì)的粗提液中不含環(huán)肽類(lèi)蛋白質(zhì).

圖8 茚三酮反應(yīng)左邊是粗提液,右邊是蒸餾水.

圖9 雙縮脲反應(yīng)結(jié)果從左到右依次是抑菌物質(zhì)的粗提液、蛋白胨水溶液、蒸餾水.

2.3.3 莫氏實(shí)驗(yàn) 拮抗菌抑菌物質(zhì)的粗提液、低溫乙醇離心后的沉淀物與莫氏試劑反應(yīng)成陽(yáng)性,濃硫酸與溶液的交界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn)(圖10).表明抑菌物質(zhì)的粗提液和沉淀物中含有糖類(lèi)物質(zhì).

2.3.4 糖的還原反應(yīng) 拮抗菌抑菌物質(zhì)的粗提液與菲林試劑反應(yīng)成陰性,無(wú)磚紅色沉淀生成(圖11).說(shuō)明拮抗菌抑菌物質(zhì)的粗提液中不含單糖,可能含有多糖.

圖10 莫氏實(shí)驗(yàn)結(jié)果從左到右依次是1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液、脫脂棉、抑菌物質(zhì)的粗提液、低溫乙醇離心后的沉淀物.

圖11 糖的還原反應(yīng)結(jié)果從左到右依次是抑菌物質(zhì)的粗提液、1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液.

3 討論

通過(guò)用抑菌圈法研究這株拮抗細(xì)菌抑菌物質(zhì)粗提液對(duì)溫度的穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、紫外線的穩(wěn)定性,為進(jìn)一步提高拮抗細(xì)菌拮抗性能提供一定參考數(shù)據(jù),同時(shí)也為拮抗細(xì)菌更好地應(yīng)用提供必要的理論依據(jù).通過(guò)對(duì)抑菌物質(zhì)粗提液進(jìn)行低溫乙醇沉淀、硫酸銨沉淀和化學(xué)性質(zhì)的研究,發(fā)現(xiàn)采用硫酸銨沉淀法得到的沉淀物有抑菌活性,可以初步判定這種物質(zhì)是蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì),而采用低溫乙醇沉淀法所得的沉淀物含有多糖類(lèi)物質(zhì),但這種沉淀物并沒(méi)有抑菌活性,所以可以初步推斷這株拮抗細(xì)菌所產(chǎn)的抑菌活性成分不是多糖類(lèi)物質(zhì),綜合顏色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果,初步判定拮抗物質(zhì)很可能是一種糖蛋白類(lèi)物質(zhì).

由于該拮抗細(xì)菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有很好的廣譜性,因此該研究也為更好地利用拮抗細(xì)菌進(jìn)行生防研究提供一定的理論參考價(jià)值.

致謝:感謝河南省科技廳對(duì)本項(xiàng)目的資助和支持.

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