洪龍燁,郭峰,國(guó)世上,趙興中

(武漢大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,人工微結(jié)構(gòu)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430072)

微流控芯片(又稱微全分析系統(tǒng)或芯片實(shí)驗(yàn)室),現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于化學(xué)合成、生物化學(xué)分析、藥物篩選、DNA測(cè)序等領(lǐng)域.微流控系統(tǒng)能夠?qū)缀跽麄€(gè)化學(xué)室的功能,包括采樣、稀釋、進(jìn)樣、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等集成在可重復(fù)使用的微芯片上,具有高通量、高靈敏度、低試劑量消耗、無(wú)交叉污染、反應(yīng)速度快和易于集成化等諸多優(yōu)點(diǎn)[1].生物系統(tǒng)是非常復(fù)雜的,即使是同類的細(xì)胞彼此之間也是千差萬(wàn)別的.針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的差異性的分析試驗(yàn)中,單細(xì)胞操控將是關(guān)鍵問(wèn)題.高效的單細(xì)胞操控技術(shù)往往成本比較昂貴,在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中難以實(shí)現(xiàn).比如,臨床腫瘤樣本總是細(xì)胞總量少,但又極具研究?jī)r(jià)值.所以如何將其收集并進(jìn)行有效的單細(xì)胞的分析是一個(gè)很有科學(xué)價(jià)值和挑戰(zhàn)性的課題[2-3].

目前流式細(xì)胞儀(flow cytometry)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞分離和檢測(cè),其可以對(duì)104以上數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行有效的操作.但是流式細(xì)胞儀昂貴,體積龐大,需要專門技術(shù)人員操作,很難在醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行廣泛的應(yīng)用.微流控芯片具成本低廉、體積微小、操作簡(jiǎn)單、樣品消耗少等特點(diǎn),可以更好地適合102～105細(xì)胞的操作和分離[4],可以非常好地克服上述局限,并可以實(shí)現(xiàn)類似儀器的小型化、集成化、便攜帶化和自動(dòng)化.微流控芯片尺寸在微米級(jí)和細(xì)胞大小相當(dāng),非常適合用于細(xì)胞的物理操控以及相關(guān)生化反應(yīng)操作[5].以微流控芯片為平臺(tái)的細(xì)胞分離技術(shù)主要有兩類：一是根據(jù)采集到信號(hào)(熒光、散射光或者阻抗)的有無(wú)或者強(qiáng)弱為判斷標(biāo)準(zhǔn)施加外部操控措施進(jìn)行篩選；二是按照細(xì)胞本身特定的物理化學(xué)特性(大小、介電常數(shù))在不同電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)作用下進(jìn)行篩選.美國(guó)加州理工大學(xué)的學(xué)者開發(fā)了一種基于熒光誘發(fā)細(xì)胞分選的微流控芯片,他們首先對(duì)待分選的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記,然后利用多層PDMS制作的微閥對(duì)以激光激發(fā)出的熒光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)弱為檢測(cè)信號(hào)來(lái)控制細(xì)胞流向,成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)表達(dá)和沒有表達(dá)綠色熒光蛋白的大腸桿菌進(jìn)行分選.光鑷分選也可以用于激光誘導(dǎo)熒光激發(fā)細(xì)胞的分選.在這種細(xì)胞分選過(guò)程中,包在鞘流中的單個(gè)細(xì)胞在488 nm激光束的照射下,通過(guò)綠色熒光蛋白表達(dá)發(fā)出熒光,經(jīng)光電倍增管轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)入計(jì)算機(jī)處理,當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到計(jì)算機(jī)所設(shè)范圍時(shí),近紅外激光啟動(dòng)光鑷作用,細(xì)胞流動(dòng)方向發(fā)生偏轉(zhuǎn),目標(biāo)細(xì)胞流向收集通道,非綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞則未受到光鑷的作用而流向廢液通道[6].Gwards等設(shè)計(jì)了一種用PDMS和玻璃芯片制作的集成化細(xì)胞分選芯片,通過(guò)檢測(cè)不同細(xì)胞阻抗值的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)分選[7],在玻璃芯片內(nèi)利用高分子化合物作為鹽橋,當(dāng)細(xì)胞通過(guò)鹽橋時(shí),引起阻抗響應(yīng)變化,這種變化與細(xì)胞大小有關(guān),因此可以用于人的紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分選.當(dāng)然還有磁力分選法,將特定的細(xì)胞表面抗原與包被在磁球上的特異性抗體結(jié)合,在外磁場(chǎng)作用下,含有特異性抗原的細(xì)胞會(huì)被吸附而停留在磁場(chǎng)中[8].

以上的實(shí)驗(yàn)和操作多是在鞘流或有溝道的微流體芯片中進(jìn)行的,與之相對(duì)比,液滴微流控芯片具有通量高、高靈敏度、無(wú)交叉污染、方便集成等特點(diǎn),其為我們進(jìn)行細(xì)胞操控和分析提供了一個(gè)強(qiáng)有力的平臺(tái)[3-4],很多技術(shù)有如光[9]、聲[10]、機(jī)械閥[11-12]、流體動(dòng)力、磁[13]、電[4,14-17]等已經(jīng)應(yīng)用到基于液滴微流控芯片的單細(xì)胞操控中.相對(duì)于以上的物理手段,電學(xué)方法有步驟簡(jiǎn)單、操作力強(qiáng)、無(wú)需特異性的標(biāo)記、反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn).我們發(fā)展了一種利用靜電作用力和流體動(dòng)力相結(jié)合的將單細(xì)胞分離形成微液滴并富集的方法.在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)微液滴的研究中,我們驚奇地發(fā)現(xiàn)在對(duì)通常利用的流聚焦溝道產(chǎn)生的微量液滴未有任何其他額外操作的情況下,微量液滴表現(xiàn)出“自帶電”的獨(dú)特行為,并對(duì)微液滴的帶電量進(jìn)行了進(jìn)一步研究[17].受此啟發(fā),我們通過(guò)集成微電極的方法對(duì)包裹有單細(xì)胞的微液滴進(jìn)行分離和篩選,改善了傳統(tǒng)液滴微流控技術(shù)收集單細(xì)胞液滴較少的問(wèn)題.

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理

在本文中,我們應(yīng)用帶有流聚焦溝道的微流控芯片來(lái)制備微液滴.連續(xù)相(油相)由左側(cè)的孔注入到芯片,分散相(水相)由左側(cè)第二個(gè)孔進(jìn)入到芯片.水相被油相在十字型流聚焦縮口處被油相的剪切力夾斷,形成連續(xù)的液滴.當(dāng)微電極上沒有作用直流電壓時(shí),所有的微液滴流動(dòng)到流體阻力較小的左側(cè)的出口中.當(dāng)微電極作用上直流電壓,微液滴將受到靜電作用力的影響,全部被引導(dǎo)流向右側(cè)的廢物通道；隨著短時(shí)間內(nèi)停止直流電壓,含有單細(xì)胞的微液滴將只受到流體動(dòng)力流向左側(cè)的收集通道,如圖1(a)所示.

2 微流控芯片制作

圖1 (a)單細(xì)胞被封進(jìn)裝液滴以及液滴分離進(jìn)入收集通道的示意圖 (b)基于微流控芯片設(shè)計(jì)圖

微流控芯片設(shè)計(jì)如圖1(b)所示,用標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)加工制備微流體芯片并將微電極用銀漿灌注方法集成于芯片中.我們先利用CorelDraw軟件設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)所需圖樣,再交由專業(yè)打印機(jī)構(gòu)精確打印,從而得到掩膜.清洗好硅片后,在其表面均勻涂上一層黏性好、厚度適當(dāng)?shù)墓饪棠z后,進(jìn)行曝光.將掩模置于光源與光刻膠之間,用紫外線等透過(guò)掩膜對(duì)光刻膠進(jìn)行選擇性照射.在光照到的地方,光刻膠發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而改變感光部位膠的性質(zhì).把此曝光過(guò)的基片用顯影液除去應(yīng)去掉的部分光刻膠,獲得與掩模相同(正光刻膠)或相反(負(fù)光刻膠)的圖形.在我們的實(shí)驗(yàn)中,采用的是AZ50正光刻膠,把顯影完的基片清洗后,在一定溫度下烘烤一段時(shí)間.在此光刻好的模板上澆注PDMS(聚二甲基硅氧烷)靜置0.5 h以上,使氣泡在重力作用下逸出.再將硅片放入電熱恒溫箱烘烤固化,進(jìn)行切片,便得到了我們實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的PDMS基片.按實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)圖樣用空心管切割法對(duì)PDMS基片打孔,和玻璃片一起經(jīng)過(guò)氧等離子處理,使得PDMS基片與潔凈的玻璃蓋片較好地鍵合在了一起,然后置于80 ℃的烘箱中烘烤兩到三天使芯片內(nèi)管道壁具有疏水性.最后再將銀漿灌注到事先切割好的PDMS槽中制成微電極.至此我們便制得了實(shí)驗(yàn)所需的微流體芯片.

3 實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果分析

圖2 單細(xì)胞微液滴的形成

圖3 (a)無(wú)細(xì)胞的微液滴或含有多個(gè)細(xì)胞的微液滴在靜電力的作用下直接進(jìn)入廢物通道;(b)單細(xì)胞微液滴通過(guò)一個(gè)10 ms直流電壓的停頓被分離出來(lái).

圖4 微液滴內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的數(shù)據(jù)圖

3.1實(shí)驗(yàn)操作步驟把2×106細(xì)胞配置在在1 mL PBS緩沖液中,將其以1∶1比例和3%的海藻酸鈉溶液相混合,充分混勻后作為分散相；把懸浮有細(xì)胞的海藻酸鈉溶液作為連續(xù)相分別加入到1 mL 注射器內(nèi),并在針頭上接好軟管,然后裝配到注射泵上；把芯片固定在顯微鏡的載物臺(tái)上；之后,將針頭上的軟管與芯片入口處的金屬管對(duì)接；調(diào)節(jié)注射泵流速,待油水兩相交匯并穩(wěn)定后,利用顯微鏡上的CCD進(jìn)行拍攝.圖2所示即為通過(guò)CCD拍攝的單細(xì)胞微液滴的形成過(guò)程.通過(guò)控制油相和分散相的流速可以很好地控制液滴的大小或者產(chǎn)生頻率,通過(guò)控制細(xì)胞的密度來(lái)控制包裹在每個(gè)微量液滴中的細(xì)胞數(shù)量分布.

為了富集單細(xì)胞微液滴,用于篩選無(wú)細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴、含有多個(gè)細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴進(jìn)入右側(cè)廢物通道的直流電壓達(dá)到400 V.在顯微鏡的觀察下,通過(guò)停止直流電壓一個(gè)較短時(shí)間(相當(dāng)于一個(gè)瞬間的低電壓脈沖),單細(xì)胞微液滴在流體動(dòng)力的作用下直接進(jìn)入左側(cè)收集通道,如圖3(a)、3(b)所示.

3.2結(jié)果分析和討論無(wú)細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴、含有單細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴、含有2個(gè)細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴以及含有多個(gè)細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴的數(shù)量比例如圖4所示.如圖所示,流聚焦方法得到的含有單細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴不到總液滴數(shù)的10%.采用此種方法得到的含有單細(xì)胞的微液滴,在細(xì)胞懸液充分打散無(wú)團(tuán)聚的情況下,液滴中的細(xì)胞數(shù)目和其微液滴數(shù)是按泊松分布的,其中含單細(xì)胞的微液滴數(shù)較少.本實(shí)驗(yàn),正是通過(guò)電分選的方法將這種數(shù)目較少的含有單細(xì)胞的微液滴篩選收集起來(lái),從而達(dá)到富集的效果.

對(duì)于微液滴表現(xiàn)出的“自帶電”的獨(dú)特行為,由于微量液滴體積微小,不便于觀察操作,直接測(cè)量電學(xué)性質(zhì)相對(duì)還是比較困難的,因此到目前也沒有得出普遍接受的結(jié)論,猜測(cè)微量液滴帶電的原因可能是感應(yīng)帶電,或者由微滴與油流之間電子與離子的轉(zhuǎn)移帶電,或是兩者同時(shí)作用.如圖3所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)這種電學(xué)操控方法可以有效地篩選單細(xì)胞微液滴,并富集由流聚焦溝道產(chǎn)生的較少的單細(xì)胞微液滴,大大改善了傳統(tǒng)液滴微流控技術(shù)收集單細(xì)胞液滴較少的弊端.

4 結(jié)論

流聚焦結(jié)構(gòu)的微流控芯片提供了一種單分散性微液滴形成的方式.從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到,這種結(jié)合了流體動(dòng)力的單細(xì)胞微液滴收集方法將會(huì)成為一種簡(jiǎn)單有效的單細(xì)胞操控分析平臺(tái)；并且這種方法相比于直接用電篩選的方法,細(xì)胞更不易受到影響和破壞,從而將獲得細(xì)胞存活率較好的單細(xì)胞微液滴,更有利于后期有效的單細(xì)胞分析.

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