彭繼慶，曹福祥 許若嫻

(中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，中國 長沙 410004)

殼菜果(MytilarialaosensisLecomte)，別名米老排、三角楓、山桐油、米顯靈、馬蹄荷、朔潘[1]，屬金縷梅科(Hamamelidaceae)殼菜果屬(Mytilaria)常綠闊葉樹種．天然林分布于廣東的封開、信陽、陽春，廣西西南部的十萬大山、龍川、那坡、德保、靖西和云南南部，老撾和越南也有分布，垂直分布在廣東海拔250～1 000 m，廣西和云南在海拔1 100～1 800 m之間的山谷、丘陵的中下部和溝谷兩旁[2]，是優(yōu)良速生用材樹種．其樹干通直，枝條較細，材質(zhì)較好，色澤美觀，經(jīng)久耐用，適于制作家具、膠合板等，在水土保持、土壤改良、混交造林、生物防火等方面作用明顯[3-4]．殼菜果葉子肥大嫩綠，營養(yǎng)成分含量較高，是一種很好的飼料資源[5]；所分泌的樹脂的化學成分主要是脂類物質(zhì)[6]，其種仁含油質(zhì)量分數(shù)高達36.8%，是重要的油脂資源[7]．目前對殼菜果的研究多集中在引種[8]、育苗造林[9]和材質(zhì)利用等方面[2-3]，而殼菜果種群遺傳多樣性方面的文章迄今未見報道．

ISSR(inter simple sequence repeat)即簡單重復序列區(qū)間擴增多態(tài)性，由Zietkiewiez等[10]在 PCR反應基礎上發(fā)展起來的一種新的分子生物學技術，ISSR標記技術與RAPD相比具有檢測位點多、穩(wěn)定可靠、重復性更好等優(yōu)點[11]；與AFLP相比具有操作簡單、技術性低、花費低等優(yōu)點，適合一般的實驗室使用．因此ISSR分子標記技術已在生物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性檢測、基因定位及遺傳圖譜等方面得到廣泛應用[12]．利用ISSR分子標記技術對殼菜果種群多樣性進行研究有助于從DNA分子水平上揭示殼菜果種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平，了解殼菜果的生存狀況和對環(huán)境的適應能力，了解殼菜果種群間的親緣關系，為殼菜果的合理開發(fā)和利用提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

殼菜果樣品分別采自廣西憑祥、廣西德保、廣西靖西、廣西那坡4個殼菜果天然分布區(qū)，采樣過程中要防止采到同一棵樹的后代；每一樣品為同一株的新鮮葉片，選取沒有病蟲害的比較干凈的葉片，用紗布擦洗干凈后放入自封袋中，加入一定量的硅膠，搖動袋子使硅膠與葉子充分接觸．將樣品放入保溫箱中，加入冰袋帶回實驗室，置于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫畼悠凡杉闆r見表1.

表1 殼菜果種群分布地的基本情況

1.2 殼菜果基因組DNA提取及檢測

殼菜果基因組DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組提取試劑盒進行提取，具體操作按照植物基因組提取試劑盒說明書進行，僅對離心時間和裂解時間稍作修改．

所提取的基因組 DNA 用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，倒膠前加入EB，終濃度為0.5 mg/L；用核酸蛋白測定分析儀檢測DNA樣品純度和濃度，將所有樣品DNA濃度稀釋為 40 mg/L，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 引物的合成與篩選

ISSR引物是根據(jù)加拿大哥倫比亞大學公布的第九套ISSR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成．從中篩選出9條擴增條帶較多、條帶清晰、重復性好的引物用于ISSR-PCR擴增．

1.4 ISSR-PCR擴增與電泳檢測

利用篩選出的9條引物對43個樣品進行PCR擴增，ISSR-PCR擴增體系為：在20 μL的反應體系中，模板DNA為30 ng，Mg2+濃度為2.75 mmol/L，TaqDNA聚合酶為36.67 nkat，dNTPs濃度為0.20 mmol/L，引物濃度為0.6 μmol/L，10×PCR Buffer 2.0 μL，最后用滅菌好的ddH2O將體系補足．擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50～54 ℃(依據(jù)引物而定)退火45 s，72 ℃延伸90 s，36個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存．擴增產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用200 bp DNA Ladder Marker(200～3 000 bp)作標記，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上成像，拍照．

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

M:200 bp DNA Ladder圖1 引物UBC835對殼菜果的多態(tài)性擴增

電泳圖譜中擴增出的每一條帶代表引物的一個結(jié)合位點，視為有效的分子標記，同一引物的擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性．根據(jù)電泳圖譜中擴增條帶的有無及擴增片段的大小，有條帶的記作“1”，否則記作“0”，建立0/1數(shù)據(jù)矩陣，通過Popgene32軟件計算殼菜果群落的多態(tài)性位點百分比(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shanon多樣性指數(shù)(I)、種群總基因多樣性(Ht)、種群內(nèi)基因多樣性(Hs)、種群間遺傳分化指數(shù)(Gst)及Nei’s遺傳距離(D)．

2 結(jié)果與討論

2.1 廣西殼菜果種群的擴增產(chǎn)物多態(tài)性

9條引物對4個種群的43份廣西殼菜果樣品進行擴增，結(jié)果顯示，9條引物均能擴增出很好的圖譜，(圖1為引物UBC836對43份廣西殼菜果樣品進行擴增的圖譜)共擴增出129條帶，平均每條引物擴增出14.3條帶，其中105條帶是多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶占81.40%，說明43個廣西殼菜果樣品的ISSR標記存在較高的遺傳多樣性．引物UBC841擴增出13條帶，有12條帶是多態(tài)性條帶，多態(tài)性最高為92.30%，引物UBC840擴增的多態(tài)性條帶最少，多態(tài)性也最低，為61.54%(表2)．

表2 ISSR引物擴增位點

2.2 廣西殼菜果自然種群的遺傳多樣性分析

4個廣西殼菜果自然種群43個樣品的遺傳多樣性分析表明(見表3)，殼菜果在物種水平上的多態(tài)位點百分率(PPB)為81.40%，表明其擁有較高的遺傳多樣性．在種群水平上，廣西憑祥種群的最高，為69.77%；其次為廣西德保和廣西靖西的種群，同時為62.79%；廣西那坡種群的最低，為54.26%.利用Popgene32軟件分析表明4個種群總體水平上的觀測等位基因數(shù)(Na)為1.845 0；有效等位基因數(shù)(Ne)為1.511 9；Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.296 9；Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.440 4．對4個種群而言，Na的變化幅度為1.542 6～1.697 7；Ne的變化幅度為1.355 9～1.471 8；H的變化幅度為0.203 1～0.268 6；I的變化幅度為0.300 4～0.394 5，其變化趨勢與種群位點多態(tài)性一致．說明廣西殼菜果自然種群具有豐富的遺傳多樣性，在這4個種群中，廣西憑祥種群適應環(huán)境的能力最強，其次為廣西德保種群和廣西靖西種群，廣西那坡種群最弱．因此，廣西憑祥的遺傳基礎最好，在將來的引種試驗中建議從廣西憑祥引種是比較合理的．

表3 殼菜果種群內(nèi)的遺傳多樣性

2.3 廣西殼菜果自然群落的遺傳分化研究

殼菜果種群總基因多樣性(Ht)為0.294 8,種群內(nèi)的基因多樣度(Hs)為0.243 0，種群間基因多樣性等于總基因多樣性減去種群內(nèi)的遺傳多樣性，即種群間的基因多樣性為0.051 8；在物種水平上有82.43%的遺傳變異存在于種群內(nèi)，而17.57%的遺傳變異存在于種群間．各個種群之間的基因分化系數(shù)Gst為0.175 8，說明殼菜果自然種群間存在一定程度的遺傳分化，但分化程度比較低．殼菜果種群間的基因流(Nm)為2.344 7，大于1，證明種群間存在一定的基因流動，足以抵制遺傳漂變的作用．

2.4 遺傳一致度與聚類分析

如表4所示，廣西殼菜果4個自然種群之間的Nei’s遺傳距離范圍在0.055 8～0.138 5之間.廣西德保和廣西靖西2個種群之間的遺傳距離最小，說明它們之間的遺傳差異最小;而廣西那坡種群與廣西憑祥之間的遺傳距離最大，為0.138 5，表明廣西憑祥與廣西那坡之間存在的遺傳差異也最大；4個種群的遺傳一致度變化范圍在0.870 7～0.945 7之間，變化趨勢與4個種群之間的遺傳距離變化趨勢一致．

表4 4個殼菜果種群間的遺傳一致度和遺傳距離

圖2 4個殼菜果種群間遺傳距離的聚類分析

根據(jù)Nei’s(1978)的遺傳距離對廣西殼菜果種群進行UPGMA聚類分析(見圖2)，聚類結(jié)果表明：4個廣西殼菜果自然種群聚為兩大類，一類是廣西德保和廣西靖西的2個種群聚在一起，再與廣西憑祥的聚在一起；廣西那坡種群單獨聚為一類．表明廣西德保與廣西靖西2個自然種群之間的親緣關系最近，與廣西那坡之間的親緣關系最遠．

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的基本特性，是物種長期進化的結(jié)果，遺傳多樣性的高低對種群的生存和分布有很大影響[13]．通過ISSR分子標記技術對殼菜果遺傳多樣性進行分析，多態(tài)位點百分率為81.40%，比廣布型植物略低，如木荷的多態(tài)位點百分率為90.02%[14]，油松的多態(tài)位點百分率為91.67%[15]，楓香的多態(tài)位點百分率為87.41%[16]，比頻危植物要高，如資源冷杉的多態(tài)位點百分率為77.78%[17]．表明盡管殼菜果的多態(tài)位點百分率比廣布型植物要低，但殼菜果仍處于較高水平，仍有很強的適應能力．廣西殼菜果的多態(tài)位點百分率介于廣布型植物和頻危植物之間，可能與兩方面原因有關：一是與廣西殼菜果自然群落的分布狀況有關，目前廣西殼菜果除了在廣西憑祥有大面積的天然林外，在廣西其他地方很少有成片的天然林，且多集中在一些林場或者在一些自然保護區(qū)，地理距離比較遠，因此殼菜果的多態(tài)位點百分率比廣布型的要低；另一方面是殼菜果結(jié)實量大，種子的含油量高達36.8%[7]，種子的萌發(fā)能力比較強，發(fā)芽率在90%左右，易于植株的存活，這與Hamrick[18]提出的具有高水平遺傳變異的物種壽命長、結(jié)實性高的觀點一致．

廣西殼菜果自然群落的遺傳分化程度比較低，種群內(nèi)的遺傳變異占主導地位，種群間遺傳變異小，這是由基因流和微環(huán)境共同作用的.基因流被視為是使種群遺傳結(jié)構(gòu)均質(zhì)化的主要因素之一, 具有廣泛基因流的物種遺傳分化程度也比較小[19]．殼菜果種群間的基因流(Nm)為2.344 7，說明基因流發(fā)揮了均質(zhì)化作用．種群間微生境的差異也是產(chǎn)生種群間遺傳分化的原因之一，不同的微生境條件下存在不同的適應型，種群的基因型之間必存在相應的差異，從而產(chǎn)生種群間的遺傳分化[20]．本研究中的殼菜果樣品均來自廣西,溫度、水分、光照、土壤等生態(tài)因子變化較小, 微生境差異不大,不同種群所承受的生境選擇壓力差異比較?。悄壳昂芏鄰V西殼菜果天然種群都被分割開來，種群之間相距比較遠，產(chǎn)生了生境片段化，而生境片段化可以阻斷原種群之間的基因交流[21]，降低遺傳多樣性，加大遺傳分化程度，估計隨著時間的推移，各種群之間的遺傳分化將逐漸增大．

本文從分子水平對殼菜果遺傳多樣性的研究，有助于了解其遺傳基礎，為種群保護、引種栽培和生產(chǎn)實踐提供參考依據(jù)；UPGMA聚類分析結(jié)果有助于探清殼菜果種群間的演化規(guī)律．但目前僅僅對廣西殼菜果天然種群進行了研究，其他省份的殼菜果的生長狀況和親緣關系還不清楚.下一步將在全國范圍內(nèi)對殼菜果進行研究，除探清殼菜果天然種群間的親緣關系外，還要探清天然林與引種地之間的差異，從分子水平上了解殼菜果是怎樣對遷移地進行適應的，對引種是否成功從分子水平上作出評價．

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