周芳亮，胡 翔，吳文韜，楊子劍，李 莉，向雙林，韓 梅，丁小鳳

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

基因擴(kuò)增是人類(lèi)腫瘤中基因過(guò)量表達(dá)的一個(gè)主要原因，其中在人類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中大量的基因擴(kuò)增是促進(jìn)其腫瘤產(chǎn)生的一個(gè)決定性因素．神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤序列41(GAS41)最初是從星型細(xì)胞瘤的4個(gè)發(fā)展階段中均擴(kuò)增到的一段高拷貝的DNA序列，它與轉(zhuǎn)錄因子AF-9和ENL結(jié)構(gòu)高度同源[1]．后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)GAS41是一個(gè)必需基因，泛素化表達(dá)于人類(lèi)組織細(xì)胞核中，其中人腦表達(dá)量最高[2-3]．而且GAS41基因在雞的前淋巴細(xì)胞系DT40中定點(diǎn)敲除后，細(xì)胞中的RNA合成大量降低，細(xì)胞隨后死亡．由此可見(jiàn)，GAS41是一個(gè)重要的管家基因，決定細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活[4]．此外，GAS41與人類(lèi)急性白血病融合蛋白MLL/AF10相互作用，參與人類(lèi)血液惡性轉(zhuǎn)化[5]．GAS41與通用轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體成員TFIIF相互作用，和特異的轉(zhuǎn)錄因子AP-2beta也相互作用促進(jìn)RNA轉(zhuǎn)錄從而參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[6-7]．最近發(fā)現(xiàn)GAS41與磷酸酶PP2Cbeta相互作用，促進(jìn)了腫瘤抑制基因P53的去磷酸化，進(jìn)而抑制腫瘤抑制基因P53信號(hào)通道[8-9]．因此，GAS41在細(xì)胞增殖與腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用．

GAS41在胚胎發(fā)育中的功能卻少有報(bào)道，作者選用新型模式生物斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象，它具有體型小、體外受精、生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)卵量大和胚胎透明等有利特點(diǎn)[10]，便于觀(guān)察和操作，以此來(lái)分析GAS41在胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜．本研究發(fā)現(xiàn)GAS41是一個(gè)高度保守的基因，泛素化表達(dá)于斑馬魚(yú)成體組織中，特異性表達(dá)于胚胎頭部．這為進(jìn)一步研究GAS41在胚胎發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為揭示GAS41在胚胎發(fā)育調(diào)控中的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料和方法

1.1 材料

斑馬魚(yú)購(gòu)自武漢中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，總RNA抽提試劑盒和RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于QIAGEN，exTaqDNA聚合酶，SP6和T7 RNA聚合酶均為T(mén)AKARA產(chǎn)品，限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶購(gòu)自NEB公司，地高辛標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche，pGEM-T Easy載體為Promega產(chǎn)品，DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司，PCR引物合成和DNA測(cè)序均在上海生工生物工程有限公司完成，質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙安比奧公司．兔抗GAS41抗體購(gòu)于Sigma公司，Alexa 488羊抗兔熒光二抗購(gòu)于Molecular Probes公司．其他常規(guī)試劑均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司．

1.2 斑馬魚(yú)GAS41基因序列分析

從GenBank中查到斑馬魚(yú)GAS41(YEATS4)基因的CDS序列(登錄號(hào)：BC076436)，GAS41蛋白在不同物種中的序列比對(duì)在DNAStar軟件Meglign程序上進(jìn)行，GAS41基因的進(jìn)化樹(shù)用CLUSTAL X軟件分析．

1.3 RT-PCR

按照總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中各時(shí)間點(diǎn)和成體斑馬魚(yú)各組織的總RNA．然后用RT-PCR方法擴(kuò)增GAS41 cDNA序列(PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為180 bp)．GAS41的RT-PCR引物序列見(jiàn)表1．PCR的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 min,變性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共28個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min．?dāng)U增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀(guān)察GAS41基因的表達(dá)情況．同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參對(duì)照．

表1 引物序列

1.4 反義RNA探針制備

載體構(gòu)建：采用RT-PCR方法以48 hpf時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎的總RNA為模板擴(kuò)增GAS41全長(zhǎng)cDNA序列(擴(kuò)增長(zhǎng)度為681 bp)．引物序列如表1． PCR的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 min,變性94 ℃ 1 min,退火56 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 1 min,共28個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min．將PCR產(chǎn)物插入pGEM-T Easy載體中，重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和SalⅠ限制性?xún)?nèi)切酶鑒定和測(cè)序分析．

探針制備：重組質(zhì)粒分別用NcoⅠ和NdeⅠ酶切線(xiàn)性化，經(jīng)SP6和T7 RNA聚合酶和地高辛標(biāo)記試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的反義RNA探針和正義RNA探針．

1.5 整體原位雜交

采用40 g/L的多聚甲醛將各個(gè)時(shí)期的胚胎于4 ℃固定過(guò)夜，甲醇梯度脫水，并置于-20 ℃的甲醇中備用．原位雜交主要步驟為：將胚胎梯度復(fù)水，用蛋白酶K處理18 hpf時(shí)期以后的胚胎，用1×PBST清洗胚胎，于65 ℃雜交爐中將胚胎進(jìn)行預(yù)雜交4 h,然后分別加入反義RNA探針和正義對(duì)照RNA探針，于65 ℃雜交爐中雜交過(guò)夜．雜交第2天回收探針,以SSCT梯度清洗胚胎,加入anti-Dig-AP抗體與反義RNA探針4 ℃結(jié)合過(guò)夜．雜交第3天回收抗體并用1×PBST溶液清洗胚胎，然后加入BCIP/NBT(Roche)染液顯色,顯色完全后用1×PBST溶液沖洗，在顯微鏡下觀(guān)察并進(jìn)行拍照記錄結(jié)果．

1.6 整體免疫組織化學(xué)

采用40 g/L的多聚甲醛將不同發(fā)育時(shí)期的胚胎于4 ℃固定過(guò)夜，將胚胎置于含有10%羊血清的1×PBST中封閉1 h,加入GAS41多克隆抗體(一抗稀釋比例1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜，1×PBST中洗滌30 min×3次．加入Alexa 488羊抗兔熒光二抗(二抗稀釋比例1∶100)于4 ℃孵育10 h, 1×PBST中洗滌15 min×3次．最后于熒光顯微鏡(Zeiss Axioskop 2)下分析熒光信號(hào)．

1.7 Western印跡雜交

圖1 斑馬魚(yú)和部分物種GAS41蛋白的同源性(A和B)與進(jìn)化樹(shù)(C)分析

將不同發(fā)育時(shí)期的胚胎加入真核細(xì)胞裂解液[50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2), 150 mmol/L NaCl, 體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100, 10 g/L sodium deoxycholate, 1 g/L SDS] 含蛋白酶抑制劑，提取胚胎總蛋白．加入SDS上樣緩沖液，105 ℃金屬浴5 min, 將蛋白質(zhì)作12%的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜．以10 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1 h,兔抗GAS41多克隆抗體為一抗,稀釋為1∶500；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，稀釋為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1∶1 000．用DAB 進(jìn)行發(fā)色顯跡．

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚(yú)GAS41基因序列的分析

使用DNAStar軟件中的MegAlign程序進(jìn)行GAS41基因在不同物種中氨基酸同源序列比對(duì)分析．結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)GAS41蛋白與人類(lèi)(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculu)和大鼠(Rattus)的氨基酸序列同源性都為91.2%．不同物種GAS41蛋白同源氨基酸序列在N端tf2f結(jié)構(gòu)域?yàn)楸Ｊ貐^(qū)域，而在C端激活結(jié)構(gòu)域有一定程度的變異[3]．人類(lèi)、小鼠和大鼠中的GAS41氨基酸序列同源性高達(dá)98.7%～99.6%(圖1A,B)．這提示GAS41蛋白質(zhì)具有高度保守性．

使用CLUSTAL X系統(tǒng)軟件進(jìn)行GAS41在不同物種中的同源序列分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖1C)．從圖中可以看出人類(lèi)的同源序列與小鼠的GAS41序列親緣關(guān)系最近，其次為大鼠,與斑馬魚(yú)GAS41關(guān)系稍遠(yuǎn)．

圖2 GAS41在斑馬魚(yú)成體組織(A)和胚胎發(fā)育不同時(shí)期(B)表達(dá)情況的RT-PCR分析

2.2 GAS41基因在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜

2.2.1 RT-PCR分析 為了研究GAS41基因在斑馬魚(yú)中的作用，作者通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)了GAS41在成體斑馬魚(yú)器官組織中的表達(dá)．圖2A顯示GAS41在斑馬魚(yú)9種主要的器官組織中均有特異性的擴(kuò)增條帶，其條帶信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有顯著差異．同時(shí)作者分析了GAS41基因在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)．GAS41基因在胚胎受精后持續(xù)表達(dá)，從4 h開(kāi)始表達(dá)量升高，一直到72 h表達(dá)量基本不變(圖2B)．

2.2.2 整體原位雜交分析 pGEM-T Easy-GAS41重組質(zhì)粒用NcoⅠ酶切經(jīng)SP6 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得反義RNA探針，用NdeⅠ酶切經(jīng)T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得正義RNA探針．RNA探針經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳(圖3B)，泳道M為DNA marker，泳道1為反義RNA探針，泳道2為正義RNA探針．探針大小約為681 bp,與預(yù)期大小相符．因RNA的復(fù)雜構(gòu)型合成的探針在普通凝膠電泳下均跑出2個(gè)清晰的條帶．

箭頭指示GAS41的表達(dá)區(qū)域：m：中腦；i：間腦；c：小腦；h：后腦．比例尺：200 μm．M: DNA marker；1: 反義探針；2:正義探針圖3 GAS41基因在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的整體原位雜交表達(dá)譜(A)和GAS41探針電泳圖(B)

與正義RNA探針相比，反義RNA探針在前期的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可特異性結(jié)合GAS41．用反義RNA探針?lè)謩e與不同發(fā)育時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎雜交，圖3A結(jié)果表明，GAS41在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中均可檢測(cè)到GAS41基因轉(zhuǎn)錄，但表達(dá)部位不同．GAS41在受精后2 h和4 h普遍性表達(dá)，8 h時(shí)集中出現(xiàn)在胚胎的一側(cè)， 斑馬魚(yú)體節(jié)期18 h開(kāi)始后GAS41特異性表達(dá)于胚胎頭部，尤其是中腦、間腦、小腦和后腦表達(dá)明顯，并且GAS41在這些部位的特異性表達(dá)一直持續(xù)至受精后48 h，專(zhuān)一性表達(dá)于腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)．

2.2.3 整體免疫組織化學(xué) 為了進(jìn)一步證實(shí)GAS41在斑馬魚(yú)頭部的表達(dá)，作者采用GAS41抗體和綠色熒光標(biāo)記的第二抗體通過(guò)胚胎整體免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)GAS41蛋白質(zhì)在胚胎發(fā)育中的表達(dá)情況．在熒光顯微鏡下觀(guān)察到受精后24，36和48 h胚胎中明顯的綠色熒光(圖4A)．信號(hào)集中出現(xiàn)在胚胎的頭部，尤其是間腦(眼部)和中腦部位高表達(dá)．同時(shí)檢測(cè)了GAS41抗體的特異性，圖4B為Western印跡分析斑馬魚(yú)不同時(shí)期GAS41蛋白質(zhì)的表達(dá)，GAS41的多克隆抗體檢測(cè)到了GAS41(25 000)，與預(yù)期蛋白大小相符，條帶單一，抗體特異性非常好，也顯示GAS41蛋白在斑馬魚(yú)胚胎受精后24～48 h均有表達(dá)，且表達(dá)水平相當(dāng)．

箭頭指示GAS41的表達(dá)區(qū)域．比例尺：200 μm. M: protein marker圖4 GAS41基因在斑馬魚(yú)胚胎不同時(shí)期表達(dá)情況的整體免疫組織化學(xué)(A)和Western印跡(B)分析

3 討論

GAS41是最早在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中通過(guò)顯微切割調(diào)節(jié)cDNA捕獲技術(shù)分離到的人類(lèi)腫瘤中高度擴(kuò)增的基因[1]．GAS41處于染色體12q13-15區(qū)域，共227個(gè)氨基酸．GAS41的N端包括tf2f結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域普遍存在于YEATS家族轉(zhuǎn)錄因子AF9和ENL中，參與基因轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)重排[3，7]．而在GAS41的C端60個(gè)氨基酸中包括大量的酸性氨基酸(27%)，是一種帶負(fù)電荷的酸性α螺旋結(jié)構(gòu)，這是真核轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域的典型特點(diǎn)，也是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域[3]．GAS41通過(guò)C端激活結(jié)構(gòu)域與MLL融合蛋白AF10相互作用參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5]．而且GAS41在雞前淋巴細(xì)胞中定點(diǎn)敲除后細(xì)胞死亡，GAS41的表達(dá)干擾后子宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯[4，11]．由此可見(jiàn)GAS41在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖和惡性腫瘤中發(fā)揮了重要的作用[4-5，8]．但GAS41在胚胎發(fā)育中的研究并未有報(bào)道．生物信息學(xué)軟件分析斑馬魚(yú)GAS41蛋白質(zhì)序列與部分物種中GAS41同源性達(dá)91.2%，該基因表現(xiàn)出較高的進(jìn)化保守性，這也說(shuō)明GAS41基因的重要性．

本研究以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物對(duì)GAS41的時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行分析，GAS41泛素化表達(dá)于成體組織(腦、心臟、肝臟、腎、肌肉、小腸、卵巢、睪丸、眼睛)中，而GAS41在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中特異性表達(dá)于胚胎頭部，尤其是中腦、間腦(眼部)、小腦和后腦表達(dá)明顯．這與此前的Northern印記雜交顯示GAS41在人腦組織中表達(dá)量最高是一致的[2-3]，這說(shuō)明GAS41在不同物種中表達(dá)的專(zhuān)一性．GAS41在胚胎體節(jié)期特異地表達(dá)于頭部的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這些表明GAS41除了維持成體組織正常生理功能外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟等過(guò)程也扮演了重要的作用．

通過(guò)顯微注射嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸使GAS41表達(dá)下調(diào)，從而分析GAS41對(duì)斑馬魚(yú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育表型及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通道的影響，由此揭示GAS41調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的機(jī)制，這些問(wèn)題仍在深入研究．總之，本研究結(jié)果為進(jìn)一步分析GAS41在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)，并且為以后深入研究GAS41在哺乳動(dòng)物發(fā)育調(diào)控中的作用機(jī)理提供了有利的線(xiàn)索．

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