孫靜靜，吳奎海，芮勇宇

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510515）

銅綠假單胞菌（PAE）廣泛分布于自然界及健康人的皮膚、腸道和呼吸道中，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，是臨床常見的條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時可引起人體局部化膿性炎癥和全身性感染，常危及生命。近年來其高分離率、高耐藥性、高病死率對臨床感染控制構(gòu)成嚴(yán)重威脅。整合子［1］和插入序列共同區(qū)［2］（Insertion sequences common regions，ISCR／orf513）作為可移動耐藥元件，在介導(dǎo)多重耐藥方面具有重要意義。整合子攜帶位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)組分，可將許多耐藥基因盒整合在一起。細(xì)菌通過整合子系統(tǒng)，在整合酶的作用下，可以捕獲外來的耐藥基因，并在位于整合子上游的啟動子的作用下得到表達(dá)，從而具有耐藥及多重耐藥性。插入序列共同區(qū)ISCR可通過滾環(huán)復(fù)制轉(zhuǎn)座鄰近的耐藥基因，并為其提供啟動子。本實(shí)驗(yàn)主要對臨床上分離的銅綠假單胞菌整合子Ⅰ和ISCR1分布研究，同時用腸桿菌科間的重復(fù)序列（Entrobacter repetive intergenic consensus，ERIC）－PCR［3］方法進(jìn)行分子流行病學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 本實(shí)驗(yàn)所用菌株分離自2010年5月至2010年9月南方醫(yī)院患者的痰液、尿液、分泌物、血液等各類標(biāo)本，共234株，均為初次分離株，且已剔除重復(fù)標(biāo)本?？剖曳植家灾匕Y監(jiān)護(hù)室（ICU）、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科、燒傷科為主，總共171株（73.1%）。利用BD Phoenix100全自動微生物分析儀析系統(tǒng)及其配套細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，頭孢哌酮／舒巴坦和米諾環(huán)素藥敏試驗(yàn)采用K－B法，藥敏紙片購自英國OXOID公司，用 WHONET5.4分析菌株藥敏情況。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 主要試劑和儀器 dNTPs、TaqDNA聚合酶、蛋白酶K和DNA Marker由大連瑞真生物技術(shù)有限公司提供。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司提供。Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、10%十二烷基磺酸鈉（SDS）為北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。德國Eppendorf公司的PCR擴(kuò)增儀器，Bio－Rad公司的凝膠成像儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株基因組 DNA的抽提SDS－蛋白酶K－酚－氯仿方法進(jìn)行提取細(xì)菌DNA并用TE液溶解，于－20℃保存。

1.3.2 整合酶Ⅰ檢測引物序列int1－F：5’－GCATCCTCGGTTTTCTGG－3’，int1－R：5’－GGTGTGGCGGGCTTCGTG－3’，目的片段457bp。反應(yīng)總體積為20μl，含 Mg2＋的10×buffer 2μl，dNTP終濃度為200μmol／L，上下游引物終濃度分別為0.2μmol／L，DNA模板1μl，TaqDNA聚合酶1U，加入滅菌去離子水至20μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸40s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中（含0.5g／ml溴化乙錠），電壓5V／cm，電泳20min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。陽性對照菌株為NF813152，由本實(shí)驗(yàn)室PCR檢測陽性且經(jīng)測序驗(yàn)證。

1.3.3 整合子Ⅰ檢測引物序列5’－CS：5’－GGCATCCAAGCAGCAAG－3’，5’－CS： AAGCAGACTTGACCTGA－3’，目的片段可變。反應(yīng)體系及退火溫度同整合酶Ⅰ。

1.3.4 ISCR1基因以及ISCR1攜帶耐藥基因的檢測：ISCR1 基因的引 物 序 列ISCR1－F：5’－ATGGTTTCATGCGGGTT－3’， ISCR1－R： 5 ’－CTGAGGGTGTGAGCGAG－3’，目的片段475bp。反應(yīng)體系同整合酶Ⅰ，退火溫度為55℃。陽性對照菌株分別為NF511434，由本實(shí)驗(yàn)室PCR檢測陽性且經(jīng)測序驗(yàn)證。ISCR1攜帶耐藥基因的引物序列ISCR1－F： 5 ’－ATGGTTTCATGCGGGTT－3 ’，SUL1－R：5’－TTTGAAGGTTCGACAGC－3’，退 火溫度60℃，片段大小為可變。

1.3.5 同源性分析 用ERIC－PCR對118株整合酶Ⅰ陽性的銅綠假單胞菌基因進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行同源性 分 析。 引 物 序 列 ERIC－2：5’－AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG－3’。反應(yīng)體系同整合酶，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，26℃退火2min，72℃延伸1min，4個循環(huán)；94℃變性1 min，40℃退火1min，72℃延伸1min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

234株銅綠假單胞菌對常見細(xì)菌的總耐藥率及整合子與耐藥的相關(guān)性分析見表1。

表1 銅綠假單胞菌耐藥情況

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 有118株（50.4%）整合酶Ⅰ陽性，95株（40.6%）整合子Ⅰ可變區(qū)陽性；ISCR1基因陽性菌株有28株（11.9%），其中有3株（1.3%）攜帶耐藥基因，同時整合子陽性（圖1，2）。118整合酶Ⅰ陽性菌經(jīng)ERIC－PCR共分為89個基因型，部分電泳圖片見圖3。其中菌株2、6、11、25、26、29、31、32、34、53、62、64、76、110為同一基因型，其他菌株多為散發(fā)。

圖1 Ⅰ類整合子可變區(qū)電泳結(jié)果

圖2 ISCR1可變區(qū)電泳結(jié)果

圖3 整合酶Ⅰ陽性銅綠假單胞菌的ERIC－PCR結(jié)果

3 討論

銅綠假單胞菌為醫(yī)院感染的主要病原菌，在我院分離率僅次于大腸埃希氏菌、鮑曼不動桿菌位居第三，主要是痰液，其次是傷口分泌物、血液、中段尿，且具有病區(qū)集中趨勢，ICU、神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科和燒傷科總的檢出構(gòu)成比＞70.0%，與患者患基礎(chǔ)疾病、抵抗力差有關(guān)。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，并且是醫(yī)院獲得性感染重要條件致病菌，應(yīng)引起臨床抗感染治療的高度重視［4］。在β－內(nèi)酰胺酶類抗生素中，可以選用碳青霉烯類藥物、頭孢他啶以及酶抑制劑復(fù)合物。在氨基糖苷類抗生素中，阿米卡星的抗菌活性最強(qiáng)。在喹諾酮類抗生素中，環(huán)丙沙星的抗菌活性較強(qiáng)。此外，也可以采用以上抗菌藥物聯(lián)合用藥治療銅綠假單胞引起的感染。

銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜［5］，包括質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的介導(dǎo)、酶的修飾鈍化作用、外膜通透性的改變、生物被膜的形成等，近年來整合子介導(dǎo)的耐藥越來越被學(xué)者們關(guān)注［6］。整合子能識別并捕獲外來基因盒，通過整合子的位點(diǎn)特異性基因重組機(jī)制使細(xì)菌耐藥基因發(fā)生擴(kuò)散。依據(jù)整合酶序列的不同，整合子可分成4種類型，Ⅰ類整合子廣泛存在于革蘭陰性桿菌中，與細(xì)菌的多重耐藥密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我院分離出的銅綠假單胞菌中整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ檢出率分別為50.4%、40.6%，說明Ⅰ類整合子在臨床銅綠假單胞菌分離株中廣泛存在，整合子檢出率和南京地區(qū)［7］（40.8%）一致。有23株整合酶Ⅰ陽性菌而整合子Ⅰ擴(kuò)增卻是陰性，可能是缺少典型的3’末端結(jié)構(gòu)［8］。ISCR1常連同多種耐藥基因插入到普通Ⅰ類整合子的3’保守末端［9］，比如A、C類β－內(nèi)酰胺酶、甲氧芐啶、氨基糖苷類耐藥基因，可介導(dǎo)形成復(fù)雜Ⅰ類整合子。本研究ISCR1的檢出率僅為11.9%，有3株菌ISCR1可變區(qū)擴(kuò)增陽性，在加上整合子Ⅰ同時陽性，這會使該類菌的耐藥播散性更強(qiáng)。

多重耐藥銅綠假單胞菌可以在特定的病房引起大規(guī)模的暴發(fā)流行［10］，給患者生命、經(jīng)濟(jì)帶來很大損失。臨床分離菌株的基因同源性分析對于流行病學(xué)調(diào)查，特別是傳染源和傳播途徑的追蹤具有重要意。對流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。腸桿菌科基因間重復(fù)序列（ERIC），其核酸為126bp，其中包含了一個高度保守的中央倒置重復(fù)序列并位于細(xì)菌染色體中的基因外區(qū)域，現(xiàn)已證實(shí)在大腸埃希菌和沙門菌屬的序列資料中是極其重要的。118株整合酶Ⅰ陽性銅綠假單胞菌分為89個基因型，說明銅綠假單胞菌呈散發(fā)存在，ERIC－PCR可把118株菌全部分型，擴(kuò)增出多態(tài)性的DNA圖譜，而且條帶清晰，其可重復(fù)性、穩(wěn)定性高。ERIC－PCR易在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室建立，是銅綠假單胞菌醫(yī)院感染流行病學(xué)研究的較理想方法。

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