胡青平 徐建國

燕麥種子萌發(fā)過程中提取物的抑菌作用研究

胡青平1徐建國2

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，臨汾 041004)
(山西師范大學(xué)食品科學(xué)與工程系2，臨汾 041004)

以4種食品腐敗菌為指示菌，采用濾紙片法和液體倍比稀釋法對(duì)裸燕麥(Avena nuda L．)種子萌發(fā)過程中不同溶劑提取物的抑菌作用和最低抑菌濃度(MIC)進(jìn)行了比較研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物的抑菌作用較好，但在種子萌發(fā)過程中抑菌效果不同，萌發(fā)24 h時(shí)燕麥種子的乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強(qiáng)，其中對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)(22．31±0．05)mm;其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度MIC小于6．25%，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的最低抑菌濃度MIC小于12．5%，旨為燕麥的綜合利用及新型天然防腐劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

燕麥種子 萌發(fā) 抑菌

燕麥(Avena L．)為禾本科一年生草本植物，是重要的糧食與飼料兼用作物，也是食品加工的重要原料。燕麥有皮燕麥(A．vena L．)和裸燕麥(A．nuda L．)之分，我國的燕麥以裸燕麥為主［1］。裸燕麥的營養(yǎng)價(jià)值在禾谷類作物中居首位，蛋白質(zhì)含量高達(dá)14%～19%［2］，氨基酸的含量多、種類齊全。燕麥中還含有亞油酸和皂甙素，能降低血清總膽固醇、甘油三脂和β2脂蛋白T，防治動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)預(yù)防和治療高血壓、冠心病和糖尿病均屬有益［3］，因此開發(fā)和利用燕麥產(chǎn)品具有重要的實(shí)踐意義。

化學(xué)合成防腐劑的安全性問題，使人們?cè)絹碓阶⒅刂参镌刺烊皇称贩栏瘎┑难邪l(fā)［4－5］。目前國內(nèi)外關(guān)于燕麥的研究主要集中在β－葡聚糖［6］、蛋白質(zhì)［7］、油脂［8］等方面的提取鑒定及其抗氧化活性［9］，而燕麥對(duì)微生物生長抑制作用的研究不多，主要有以下報(bào)道:皮燕麥的根皂甙提取物［10－11］、幼苗的黃酮類和皂苷類提取物［12］、種子的水提取物［13］、皮燕麥中的甾醇提取物［14］和裸燕麥麩皮中的β－谷甾醇提取物［15］均有不同程度的抑菌作用。但對(duì)其抑菌作用的研究存在一些局限性:(1)燕麥品種以皮燕麥為主;(2)對(duì)抑制食品腐敗菌的研究較少;(3)對(duì)燕麥萌發(fā)過程中抑菌作用的動(dòng)態(tài)變化未見詳細(xì)報(bào)道;這些不足限制了燕麥天然防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用推廣。因此，本研究以裸燕麥為研究對(duì)象，采用濾紙片法和液體倍比稀釋法對(duì)其種子萌發(fā)過程中不同溶劑初提物的抑菌作用和最低抑菌濃度MIC進(jìn)行了比較研究，旨為我國特色燕麥資源——裸燕麥的綜合利用及新型天然防腐劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

燕麥:壩筱1號(hào)。

1．2 供試菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis):山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1．3 儀器與設(shè)備

HY－4型調(diào)速多用振蕩器:江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;YWQ－LS－STT型自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SPX－300BG型生化培養(yǎng)箱:國華電器;722分光光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1．4 方法

1．4．1 燕麥種子提取物的制備

準(zhǔn)確稱取粉碎的燕麥樣品20．0 g，平均分成4份，放入250 mL的三角瓶中，分別加入50 mL的蒸餾水、甲醇、丙酮和乙酸乙酯。30℃下超聲30 min后，于8 000 r/min離心15 min，濾渣重復(fù)提取1次。合并上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，定容10 mL，4℃保存4種提取液備用。

1．4．2 燕麥種子萌發(fā)過程中提取物的制備

燕麥種子萌發(fā)樣品分別是:原種子、浸泡12 h、發(fā)芽12 h、發(fā)芽24 h、發(fā)芽36 h、發(fā)芽48 h、發(fā)芽60 h，共7個(gè)處理。準(zhǔn)確稱取粉碎的7個(gè)萌發(fā)過程中的燕麥樣品各5．0 g，按照1．4．1中所描述的方法，用乙酸乙酯提取各樣品，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4．3 指示菌液的制備

將保存的各種指示菌種接種于LB斜面培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，活化2次。用接種環(huán)挑取少量活化管中的指示菌于裝有玻璃珠及50 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，振蕩培養(yǎng)14 h，采用麥?zhǔn)蠞岫确ǎ?6］測(cè)量菌濃，即用生理鹽水配置成梯度菌液，以麥?zhǔn)?．5標(biāo)準(zhǔn)管為對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)量560 nm下的OD值，選擇與0．5號(hào)麥?zhǔn)蠞岫认嗤木鷳乙?，指示菌濃度約為108cfu/mL。

1．4．4 燕麥種子提取液的抑菌試驗(yàn)

采用濾紙片法［16］測(cè)定燕麥種子萌發(fā)過程中提取物的抑菌作用。先用無菌棉簽沾取菌液，涂布于LB培養(yǎng)基上，而后用無菌鑷子夾取直徑8 mm無菌濾紙片，將濾紙片貼在含菌平板上，輕壓濾紙片使其與培養(yǎng)基接觸良好，每皿貼4片，呈十字形對(duì)稱放置，在每個(gè)濾紙片上，滴加30μL經(jīng)微孔過濾器過濾的四種提取液，對(duì)稱的兩個(gè)濾紙片為對(duì)照組。等待檢液完全滲入后，將平板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，定時(shí)觀察，并測(cè)定抑菌圈的大小，比較抑菌效果。

1．4．5 乙酸乙酯提取液MIC的確定

采用液體倍比稀釋法［17］，選取發(fā)芽24 h燕麥種子的乙酸乙酯提取物(按100%計(jì))，稀釋成50%、25%、12．5%、6．25%、3．12%5個(gè)梯度濃度的稀釋液，在無菌條件下，分別取100μL稀釋液與1μL 0．5麥?zhǔn)蠞岫鹊母骶夯靹?，均勻涂布于平板上，每種指示菌的每個(gè)提取稀釋液重復(fù)3次。同時(shí)取1．1 mL 0．5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙和坎?，作為陰性?duì)照;另取一不加任何物質(zhì)的平板，作為陽性對(duì)照。37℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，以不長菌的提取物的最小濃度為該提取物的MIC。

1．5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進(jìn)行ANOVA分析(P＜0．05)。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同溶劑提取物抑菌效果的比較

用濾紙片法分別對(duì)水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的燕麥提取物進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見表1和圖1。

表1 不同溶劑燕麥種子提取物的抑菌效果/mm

圖1 不同溶劑燕麥種子提取物的抑菌結(jié)果

由表1和圖1可以看出，燕麥種子的水提取物對(duì)4種指示菌都沒有抑制作用，甲醇、丙酮、乙酸乙酯的燕麥種子提取物對(duì)4種指示菌都有不同程度的抑制作用，其中，乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強(qiáng)，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最為顯著，其相對(duì)抑菌圈大小分別為(12．75±0．05)mm和(12．54±0．03)mm。所以，選取乙酸乙酯提取物備用。

2．2 燕麥種子萌發(fā)過程中乙酸乙酯提取物的抑菌作用

用濾紙片法，對(duì)燕麥種子萌發(fā)過程中的7個(gè)處理乙酸乙酯提取物的抑菌進(jìn)行了比較，即未處理、浸泡12 h、發(fā)芽12 h～60 h(每12 h取1次樣)，結(jié)果見表2和圖2。

由表2和圖2結(jié)果顯示，燕麥種子在萌發(fā)過程中抑菌效果不同，隨種子發(fā)芽時(shí)間的增長抑菌效果越明顯，但達(dá)到一定時(shí)間后又下降。其中，燕麥種子發(fā)芽24 h時(shí)的乙酸乙酯提取物的抑菌效果最好(P＜0．05)，尤其是對(duì)大腸桿菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于其他3種菌(P＜0．05)，其抑菌大小順序?yàn)榇竽c桿菌＞鼠傷寒沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌＞腸炎沙門氏菌，其中對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)(22．31±0．25)mm。這可能是由于在燕麥種子萌發(fā)過程中，抑菌物質(zhì)的種類和含量發(fā)生變化導(dǎo)致的。

表2 燕麥種子萌發(fā)過程中乙酸乙酯提取物的抑菌效果/mm

圖2 燕麥種子萌發(fā)過程中乙酸乙酯提取物的抑菌效果

2．3 乙酸乙酯提取物MIC的測(cè)定

經(jīng)發(fā)芽24 h的燕麥種子，用乙酸乙酯提取的抑菌物質(zhì)，對(duì)4種指示菌的MIC結(jié)果見表3。

表3 乙酸乙酯提取物對(duì)4種指示菌的MIC/%

MIC是衡量抗菌活性大小的一個(gè)指標(biāo)，由表3結(jié)果顯示，當(dāng)指示菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌時(shí)，乙酸乙酯提取物的MIC小于6．25%;當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌為指示菌時(shí)，乙酸乙酯提取物的MIC小于12．5%，說明燕麥種子萌發(fā)24h的乙酸乙酯提取物對(duì)前2種指示菌的抑菌作用強(qiáng)于后2種指示菌。

3 討論與結(jié)論

不做任何處理的燕麥種子的4種提取物中，乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌圈直徑達(dá)(13．51±0．03)mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)(12．54±0．03)mm;燕麥種子不同萌發(fā)時(shí)間的乙酸乙酯提取物，具有不同的抑菌效果，其中萌發(fā)24 h的燕麥種子乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)(22．31±0．05)mm;萌發(fā)24 h的燕麥種子乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度MIC小于6．25%，而對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的最低抑菌濃度MIC小于12．5%?？梢?，發(fā)芽可作為提高燕麥利用價(jià)值的有效手段。燕麥富含多酚、黃酮、甾醇等多種不同極性的活性物質(zhì)，且這些物質(zhì)在萌發(fā)過程中會(huì)有不同的變化［18］。因此，燕麥萌發(fā)過程中不同溶劑提取物的組成成分、結(jié)構(gòu)及其抑菌機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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Study on the Antimicrobial Effect of Oat Seeds Extracts during the Germination

Hu Qingping1Xu Jianguo2
(College of Life Science，Shanxi Normal University1，Linfen 041004)
(Department of Food Science and Engineering，Shanxi Normal University2，Linfen 041004)

Taking oat(Avena nuda L．)seeds as subject，Paper－disc and double dilution as methods，antibacterial activity of different solvents(water，methanol，acetone and ethyl acetate)from oat and the Minimal Inhibitory Concentration(MIC)of ethyl acetate extract on four food corruption bacteria were investigated．The results showed that the inhibition of ethyl acetate extract on bacteria was better than other solvents extracts．But the antibacterial activity was changing in the germination of oat seeds．If oat seed was germinated for 24 h，the ethyl acetate extracts had the strongest antibacterial activity on four bacteria，about(22．31±0．05)mm of inhibition diameter against Escherichia coli．The Minimal Inhibitory Concentration(MIC)on Staphylococcus aureus and E．coli were less than 6．25%．However，MIC on Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis were less than 12．5%．This paper provides theoretical references for the comprehensive utilization of oat and development of new type of natural antiseptic．

oat seed，germination，antibacterial activity

TS201．3

A

1003－0174(2012)06－0027－04

時(shí)間:2012－05－31 16:46

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20120531．1646．004．html

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071722)，中國博士后基金(2011M501444)，山西省優(yōu)秀人才支撐項(xiàng)目(晉教科［2011］4號(hào))，山西省軟科學(xué)(2010041031－02)

2011－10－12

胡青平，女，1972年出生，副教授，博士，應(yīng)用微生物

徐建國，男，1971年出生，副教授，博士，植物資源開發(fā)利用