賈 燕，和晉渝，王世博，李迎麗，邱景富

（重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016）

某三級(jí)甲等醫(yī)院肺炎克雷伯菌耐藥性及耐藥基因分析Δ

賈 燕＊，和晉渝，王世博，李迎麗#，邱景富

（重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016）

目的：分析某三級(jí)甲等醫(yī)院連續(xù)4年肺炎克雷伯菌的耐藥性及耐藥基因分布，了解耐藥性變化趨勢(shì)，指導(dǎo)臨床合理用藥。方法：使用VITEK-32全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，用紙片法和最低抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)進(jìn)行藥敏分析，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株可能攜帶的主要β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：在182株臨床分離的肺炎克雷伯菌中，痰和咽拭子標(biāo)本分離率占首位（78.6%）；對(duì)檢測(cè)的13種抗菌藥物耐藥譜分析顯示，該菌對(duì)哌拉西林耐藥率最高，對(duì)亞胺培南和美羅培南敏感；產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率約30%；51%以上的產(chǎn)ESBLs菌株攜帶至少1種所檢測(cè)的耐藥基因，以blaTEM為主。結(jié)論：該院肺炎克雷伯菌分離株耐藥范圍廣、產(chǎn)ESBLs菌檢出率高，應(yīng)引起重視。

肺炎克雷伯菌；耐藥性；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；β-內(nèi)酰胺酶基因

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染中常見(jiàn)致病菌之一，也是醫(yī)院感染和機(jī)會(huì)感染的重要病原菌[1]。近年來(lái)，肺炎克雷伯菌的耐藥性呈上升趨勢(shì)，臨床大量、不合理使用抗生素造成了呼吸道感染菌群變化及其耐藥性增加，其耐藥性的變遷和現(xiàn)狀也備受關(guān)注[2]。本文回顧性分析連續(xù)4年某三級(jí)甲等醫(yī)院臨床分離肺炎克雷伯菌的分布、耐藥性、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株的檢出率及β-內(nèi)酰胺酶基因的存在情況，以了解臨床常用抗菌藥物的耐藥性現(xiàn)狀和耐藥率的變化，為臨床診斷及治療、合理使用抗菌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源。某三級(jí)甲等醫(yī)院連續(xù)4年住院患者送檢的痰液、咽拭子、尿、血等標(biāo)本，按常規(guī)方法接種于血平板。同一人多次培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果只計(jì)1株。

1.1.2 儀器。VITEK-32全自動(dòng)微生物分析儀（法國(guó)Bio-Merieux公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定。所有菌株分離純化得到單菌落后鑒定到種。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)。采用紙片法和最低抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)測(cè)定肺炎克雷伯菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星等13種抗菌藥物的耐藥性。判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2010年版的規(guī)定[3]。

1.2.3 產(chǎn)ESBLs菌株的確證試驗(yàn)。采用CLSI 2010年版推薦的藥敏紙片擴(kuò)散表型確證法[3]進(jìn)行檢測(cè)，判定標(biāo)準(zhǔn)為使用2組藥敏紙片：頭孢他啶（CAZ）、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟（CTX）、頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CA），當(dāng)2種藥物中任意一組加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈直徑增大≥5 mm時(shí)，可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs菌株。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株可能攜帶的主要6種耐藥基因。用煮沸法提取細(xì)菌DNA，各型β-內(nèi)酰胺酶基因引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌在各類(lèi)標(biāo)本中的分布

對(duì)182株臨床分離的肺炎克雷伯菌在各分離標(biāo)本中的分布進(jìn)行分析，來(lái)源于痰和咽拭子標(biāo)本的共143株，占總數(shù)的78.6%，分離率占首位；分離自尿、血和其他標(biāo)本的分別為12、11和16株，共占21.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于痰和咽拭子標(biāo)本的分離率。

2.2 肺炎克雷伯菌的耐藥率

肺炎克雷伯菌對(duì)13種常用抗菌藥物的耐藥率見(jiàn)表1。

表1 182株肺炎克雷伯菌對(duì)13種抗菌藥物的耐藥率統(tǒng)計(jì)Tab 1 Resistance rates of 182 clinical isolates of K.pneumoniae to 13 kindsof antibiotics

由表1可見(jiàn)，肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南最為敏感，敏感率均為98.4%；耐藥率最高的為哌拉西林，高達(dá)47.8%。

2.3 產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs菌株耐藥率分析

臨床分離的182株肺炎克雷伯菌中，產(chǎn)ESBLs菌株共54株，產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率約為30%（54/182＝29.7%）。產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)13種常用抗菌藥物的耐藥率見(jiàn)表2。

2.4 肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs菌株的主要耐藥基因檢測(cè)

用PCR法對(duì)43株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌可能攜帶的主要β-內(nèi)酰胺酶基因（blaTEM、blaSHV、blaOXA-1群、blaCTX-M-1群、blaCTX-M-2群和blaCTX-M-9群）進(jìn)行分析，PCR擴(kuò)增所用引物序列見(jiàn)表3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖1，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果表明，51%以上的產(chǎn)ESBLs菌株攜帶至少1種所檢測(cè)的耐藥基因，其中有6株菌同時(shí)攜帶2～3種耐藥基因（blaTEM、blaSHV和blaCTX-M-1），有21株攜帶有blaTEM基因（48.8%），3株blaSHV基因擴(kuò)增陽(yáng)性（7.0%），5株blaCTX-M-1基因擴(kuò)增陽(yáng)性（11.6%），而bla-OXA-1、blaCTX-M-2和blaCTX-M-9未檢測(cè)到陽(yáng)性菌株。

表2 182株菌中產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)13種抗菌藥物的耐藥率統(tǒng)計(jì)Tab 2 Resistance rates of ESBLs-producing and non-ESBLs-producing strains in 182 clinical isolates to 13 kinds of antibiotics

表3 產(chǎn)ESBLs菌株β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)引物統(tǒng)計(jì)Tab 3 The list of primers used forβ-lactamases gene detection in ESBLs-producing isolates

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖1.Marker DL2000；2、4、6.分別為blaTEM、blaSHV和blaCTX-M-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3、5、7.分別為陰性對(duì)照Fig 1 Electrophoresis of PCR products1.Marker DL2000；2，4，6.PCR products for blaTEM，blaSHV and blaCTX-M-1 gene；3，5，7.negativecontrol

3 討論

肺炎克雷伯菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染尤其是呼吸道感染的常見(jiàn)條件致病菌之一，其引起的感染多發(fā)生在肺、泌尿道、血液和創(chuàng)傷面等部位，可引起肺炎、尿路感染、菌血癥等。本文對(duì)182株臨床分離肺炎克雷伯菌進(jìn)行了分析，78.6%的分離株來(lái)自痰和咽拭子標(biāo)本，提示該菌主要引起呼吸道感染，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。

由于抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌耐藥菌株呈逐年上升趨勢(shì)。本文數(shù)據(jù)分析表明，該菌對(duì)第2代頭孢菌素有較高的耐藥性，對(duì)第3、4代頭孢菌素耐藥性也在不斷增加，而對(duì)亞胺培南、美羅培南較為敏感，碳青霉烯類(lèi)可作為肺炎克雷伯菌感染的首選抗菌藥物。

產(chǎn)ESBLs是肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素主要的多重耐藥機(jī)制，ESBLs不僅能分解廣譜青霉素和第1、2、3代頭孢菌素，而且還能分解第4代頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，同時(shí)對(duì)氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)有交叉耐藥，給臨床治療感染性疾病帶來(lái)很大困難。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率約30%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的發(fā)生率基本一致[9]。產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌呼吸道感染最為多見(jiàn)，提示醫(yī)院感染管理機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)病患呼吸道的監(jiān)控護(hù)理，警惕耐藥株產(chǎn)生引起醫(yī)院感染的發(fā)生。

本文對(duì)產(chǎn)ESBLs菌與非產(chǎn)ESBLs菌的耐藥性進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示產(chǎn)ESBLs菌的耐藥性顯著高于非產(chǎn)ESBLs菌株。產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)除亞胺培南、美羅培南外其他11種檢測(cè)抗菌藥物都耐藥。產(chǎn)ESBLs菌與非產(chǎn)ESBLs菌對(duì)亞胺培南均敏感，建議保護(hù)性使用此藥，維持其抗菌活性，可用于治療ESBLs菌株引起的重度感染。

ESBLs型別日益增多，新的β-內(nèi)酰胺酶基因也不斷地被報(bào)道，目前主要以blaTEM、blaSHV和blaCTX-M型為主。本文結(jié)果顯示該院流行的主要基因型為blaTEM，與周軍等[10]的報(bào)道一致，而與朱衛(wèi)民等[4]的數(shù)據(jù)有些不同，推測(cè)可能與樣本收集時(shí)間、來(lái)源等不一樣有關(guān)。分析結(jié)果表明該院存在較為嚴(yán)重的ESBLs流行現(xiàn)狀，β-內(nèi)酰胺酶基因的存在和傳播可能是導(dǎo)致產(chǎn)ESBLs菌株流行的主要原因之一。為降低產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率，應(yīng)加強(qiáng)控制抗菌藥物的使用。

抗菌藥物的使用對(duì)細(xì)菌耐藥性有明顯的選擇性壓力，抗菌藥物在醫(yī)院、社區(qū)濫用是產(chǎn)生耐藥的重要原因。應(yīng)控制醫(yī)院感染，開(kāi)展常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)并定期公布，嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離制度，避免或減少醫(yī)源性交叉感染；循環(huán)使用抗菌藥物，根據(jù)肺炎克雷伯菌耐藥譜變化及年用量，限制用藥范圍和用量，抑制耐藥菌株流行。醫(yī)院應(yīng)建立細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)體系，及時(shí)開(kāi)展細(xì)菌耐藥譜的分析，掌握耐藥趨勢(shì)，以指導(dǎo)臨床合理用藥，控制多重耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播。

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Analysis of Antibiotics Resistance of Klebsiella Pneumoniae and Drug Resistance Gene from a Class Three Grade A Hospital

JIA Yan，HE Jin-yu，WANG Shi-bo，LI Ying-li，QIU Jing-fu
（School of Public Health and Management，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To analyze the antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae and distribution of drug resistance gene from a class three grade A hospital in order to investigate the trend of drug resistance change and guide the rational use of antibiotics in the clinic.METHODS：The identification of K.pneumoniae isolates from clinical samples was performed by the VITEK-32 system.The susceptibility test to antimicrobial agents was determined by Disk Diffusion and MIC testing.Detection ofβ-lactamases gene in the ESBLs-producing isolates was performed using PCR.RESULTS：The highest detection rate of K.pneumoniae was found from sputum and throat swab（78.6%）.As to K.pneumoniae，the resistance ratio to piperacillin was the highest，while imipenem and meropenem was sensitive to bacterial.The detection rate of ESBLs-producing strains was almost 30%.More than 51%of ESBLs-producing strains carried at least a kind of detectedβ-lactamases genes.Among them，blaTEM gene was the main prevalence gene.CONCLUSION：K.pneumoniae isolates show extensive drug resistance in the hospital with high detection rate of ES

BLs-producing strains，which should get more attention in the clinic.

Klebsiella pneumoniae；Drug resistance；ESBLs；β-lactamases gene

R978.1；R969.3；R378

A

1001-0408（2012）30-2824-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.30.16

2012-02-21

2012-03-03）