劉丹尹東孫惦許旻何明

脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能激發(fā)過度的炎癥反應，產(chǎn)生膿毒血癥[1]。心臟是膿毒血癥中最易受損的主要靶器官之一[2]，因此，為降低膿毒血癥的病死率，減輕心臟功能損傷極為重要。本課題組前期在內(nèi)毒素整體動物模型上觀察到，內(nèi)毒素血癥時心肌14-3-3γ表達增加，提示14-3-3γ可能在內(nèi)毒素所致的心肌損傷中發(fā)揮重要作用[3]。本研究擬構(gòu)建pFLAG-14-3-3γ重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，旨在從細胞水平探討其在心肌細胞損傷中的作用，并進一步檢測凋亡的重要調(diào)節(jié)因子Bax的表達與分布，深入探討14-3-3γ的保護機制。

1 材料與方法

1.1 受試藥品與主要試劑 pFLAG-CMVTM-4質(zhì)粒（Sigma公司），限制性內(nèi)切酶 Eco RⅠ和 KpnⅠ（NEB），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、凝膠回收試劑盒及無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒 （Promega 公司），14-3-3γ 抗體、Bax抗體、β-actin 抗體及相應二抗 （Santa Cruz），線粒體分離試劑盒 （Biovision公司），LipofectamineTM2000 （Invitrogen），MEM 培養(yǎng)基（GIBCO BRL公司產(chǎn)品），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），增強化學發(fā)光印跡試劑和硝酸纖維素膜（Amersham公司），胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素,丙烯酰胺、SDS，亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、EDTA和 DTT（Sigma公司產(chǎn)品），其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞的分離培養(yǎng) 參照文獻[4]方法略加改進，以下操作均在超凈臺內(nèi)進行。取出生1～3 d的SD乳鼠，開胸取出心臟，分離心室組織，經(jīng)0.1%胰酶消化分離，用含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基混懸后置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）培養(yǎng)2 h去除成纖維細胞，臺盼藍鑒別細胞存活率在90%以上者用于實驗，然后按5×105/孔、1×104/孔分別接種于6孔培養(yǎng)板和96孔培養(yǎng)板內(nèi)，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，前3 d加入終濃度為0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶核苷 （Brdu）抑制纖維細胞生長。培養(yǎng)4 d隨機分組進行實驗。

1.2.2 實驗分組（1）對照（Control）組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及未經(jīng)LPS處理組。（2）LPS組：加LPS至培養(yǎng)液中，終濃度為10 mg/L，孵育6 h。（3）pFLAG+LPS組：空載質(zhì)粒pFLAG轉(zhuǎn)染至心肌細胞中，24 h 后處理同 LPS 組。（4）pFLAG-14-3-3γ+LPS 組：重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ轉(zhuǎn)染至心肌細胞中，24 h后處理同LPS組。

1.2.3 14-3-3γ真核表達載體pFLAG-14-3-3γ的構(gòu)建 取SD鼠心肌組織 50 mg，用 RT-PCR方法獲取 14-3-3γ（GenBank D17447.1）的全長編碼 cDNA，引物序列 上游：5′-AAGAATTCCCCCGCGAAGATG-3′， 下游：5′-TTAGGTACCTG GGGCCTTAGTTGTT-3′，分別在上、下游引物中引入 Eco RⅠ和KpnⅠ的酶切位點及保護性堿基。PCR擴增后的目的基因cDNA與質(zhì)粒pFLAG-CMVTM-4用 Eco RⅠ和 KpnⅠ雙酶切、T4連接酶連接。連接反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞并用抗生素篩選。質(zhì)粒提取后，行酶切鑒定和DNA測序。

1.2.4 pFLAG-14-3-3γ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及表達效率的檢測 在轉(zhuǎn)染前，PBS洗2次，除去抗生素，將 LipofectamineTM2000（μL）與 DNA（μL）以 2.0∶0.8 比例混合，加入到每孔細胞中，置于培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中孵育。24h后裂解細胞，提取蛋白，Western blot檢測心肌細胞14-3-3γ蛋白表達。以空載質(zhì)粒載體pFLAG為對照。

1.2.5 細胞存活率檢測 采用MTT比色法檢測。胰酶消化后收集細胞，每組細胞以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。細胞覆蓋率達70%～80%后吸出培養(yǎng)基。每孔加入MTT溶液（5 g/L溶于PBS）20μL，37℃孵育4 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，再每孔加DMSO 150μL振蕩10 min，使藍色結(jié)晶充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光密度（OD）值，以間接反映各組活細胞數(shù)。

1.2.6 生化檢測 各組分別取孵育液200μL，美國Beckman生化自動分析儀測定乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸酶（CPK）活性。當心肌細胞受損時，LDH及CPK會釋放至孵育液中，使得LDH及CPK值升高，故LDH、CPK值與心肌細胞損傷成正比。

1.2.7 細胞凋亡檢測 收集各組細胞，在細胞懸液中加入10 μL Annexin V-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，再加入300μL Binding buffer，立即進行流式細胞儀檢測。

1.2.8 Western blotting檢測線粒體和胞漿中Bax蛋白水平 各組使用線粒體和胞漿蛋白制備試劑盒，按操作說明書制備線粒體和胞漿蛋白。同等量蛋白質(zhì)完成SDS-PAGE后，進行電轉(zhuǎn)膜，再先后結(jié)合一抗和二抗，最后X線膠片曝光分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染 pFLAG-14-3-3γ對心肌細胞14-3-3γ蛋白表達的影響 pFLAG組的14-3-3γ蛋白表達與對照組相比無明顯升高，pFLAG-14-3-3γ組的14-3-3γ蛋白表達高于對照組和pFLAG組 （P<0.001）。說明重組14-3-3γ的真核表達載體在原代乳鼠心肌細胞中能有效表達，見圖1、表1。

Figure 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups圖1 14-3-3γ蛋白在各組中的表達

Table 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups表1 14-3-3γ蛋白在各組中的表達 （n=6，±s）

Table 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups表1 14-3-3γ蛋白在各組中的表達 （n=6，±s）

**P<0.01

?

2.2 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對LPS損傷后細胞存活率的影響 LPS組與對照組比較細胞存活率明顯降低（P<0.001）；而轉(zhuǎn)染了pFLAG-14-3-3γ的心肌細胞能明顯對抗隨后LPS所致?lián)p傷，使細胞存活率明顯升高（P<0.001），見表2。

Table 2 Comparison of cell viability,LDH,CPK and apoptotic rate between different groups表2 各組細胞存活率、LDH及CPK活性、細胞凋亡率比較 （n=6，±s）

Table 2 Comparison of cell viability,LDH,CPK and apoptotic rate between different groups表2 各組細胞存活率、LDH及CPK活性、細胞凋亡率比較 （n=6，±s）

**P<0.01；（1）∶（2）～（4），（2）∶（4），（3）∶（4）， 均 P<0.001，（2）∶（3）P>0.05

?

2.3 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對LPS損傷后LDH、CPK的影響 LPS處理使LDH及CPK較對照組明顯升高（P<0.001），而轉(zhuǎn)染了pFLAG-14-3-3γ的細胞再受到LPS損傷處理，LDH及 CPK較LPS組及pFLAG+LPS 組明顯降低（P<0.001），見表2。

2.4 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對LPS損傷后細胞凋亡的影響 LPS處理使心肌細胞凋亡率較對照組明顯增加（P<0.001），轉(zhuǎn)染 pFLAG-14-3-3γ 的細胞能明顯對抗LPS所致的損傷，與LPS損傷組相比細胞凋亡率明顯減少（P<0.001），見表2、圖2。

Figure 2 The cell apoptosis detected by flow cytometry in different groups圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

2.5 14-3-3γ基因轉(zhuǎn)染對LPS損傷后Bax表達與分布的影響 對照組Bax主要分布在胞漿，當心肌細胞遭受LPS損傷時，Bax移位至線粒體，胞漿/線粒體（cyto-Bax/mito-Bax）比值較對照組明顯減少（P<0.001）。轉(zhuǎn)染 pFLAG-14-3-3γ 能明顯對抗Bax向線粒體的移位，使cyto-Bax/mito-Bax比值較LPS組和 pFLAG+LPS組明顯升高（P<0.001），見表3、圖3。

Table 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups表3 各組中胞漿、線粒體Bax蛋白水平 （n=6，±s）

Table 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups表3 各組中胞漿、線粒體Bax蛋白水平 （n=6，±s）

**P<0.01

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Figure 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups圖3 各組中胞漿、線粒體Bax蛋白水平

3 討論

3.1 14-3-3蛋白的基本生理作用 14-3-3蛋白是存在于幾乎所有生物體細胞中的一類重要蛋白質(zhì)家族，共有 β、ε、γ、η、σ、τ、ζ7 個亞型。14-3-3 蛋白主要通過與配體蛋白的相互作用，參與細胞周期、細胞凋亡、緊張反應和信號轉(zhuǎn)導調(diào)控[5]。其中14-3-3蛋白最常見的作用方式就是將其配體蛋白限制在某一特定部位，通常是在胞漿，使其無法到達功能部位發(fā)揮作用[6]。

3.2 pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒對心肌LPS損傷的對抗作用 本課題組前期實驗中發(fā)現(xiàn)，14-3-3γ在大鼠燒傷及內(nèi)毒素損傷模型中心肌表達明顯升高[3]，高度懷疑此蛋白可能在內(nèi)毒素致心肌損傷過程中發(fā)揮重要作用。為驗證此假說，并排除整體動物實驗多因素干擾，筆者構(gòu)建了pFLAG-14-3-3γ重組質(zhì)粒，建立原代SD乳鼠心肌細胞LPS損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3γ后，心肌細胞能明顯對抗隨后發(fā)生的LPS損傷，使細胞存活率升高，細胞損傷減輕，表現(xiàn)為LDH、CPK活性下降，心肌細胞凋亡減少。

3.3 pFLAG-14-3-3γ抗心肌LPS損傷作用與抑制Bax線粒體移位有關 有文獻報道，在神經(jīng)細胞胞漿中14-3-3蛋白與Bcl-2家族中的Bax結(jié)合[7]。Bcl-2家族是在細胞凋亡過程中發(fā)揮關鍵性作用的一類蛋白質(zhì)，主要是通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，影響線粒體的功能來完成對細胞凋亡的調(diào)控。Bax是Bcl-2家族中的促細胞凋亡蛋白成員，通常情況下，Bax蛋白一般存在于胞漿內(nèi)，受到相關的凋亡信號刺激時，移位至線粒體，直接或間接地與線粒體通道蛋白相互作用，引起促凋亡因子細胞色素C等的釋放[8]。為此，本實驗檢測了Bax蛋白在細胞漿與線粒體中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當心肌細胞遭受LPS損傷時，Bax蛋白由胞漿向線粒體轉(zhuǎn)移，而當轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3γ后，Bax蛋白的這種向線粒體遷移則明顯抑制，說明在心肌細胞胞漿中14-3-3γ能抑制LPS誘導Bax向線粒體的轉(zhuǎn)移，進而維持線粒體膜的穩(wěn)定性，起到對抗LPS損傷的作用。

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