梁桂文 姜敏輝

水蛭是調(diào)節(jié)血脂、破血逐瘀的傳統(tǒng)中藥，其抗凝作用已經(jīng)受到普遍認(rèn)可。近年來有實(shí)驗(yàn)研究顯示，小劑量水蛭具有保護(hù)血管內(nèi)皮，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用[1-2]。目前阿托伐他汀保護(hù)內(nèi)皮作用已得到共識[3]。本研究旨在評價(jià)水蛭在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中對動(dòng)脈內(nèi)皮的保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級健康雄性日本大耳白兔55只，體質(zhì)量（2.4±0.2）kg，購于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。水蛭購自南通大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房（過400目篩），阿托伐他汀由輝瑞公司饋贈(zèng)，藥物送飼料廠加工入飼料給藥。飼料購自蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司。NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所（硝酸還原法），內(nèi)皮素（ET）-1、前列環(huán)素（PG）F-1-α、血栓烷（TX）B2及 C反應(yīng)蛋白（CRP）試劑盒購自上海滬峰化工有限公司。

1.2 方法 隨機(jī)選取7只為正常對照（A）組，予以普通飼料120 g/d喂養(yǎng)，模型組48只予以高脂飼料（1%膽固醇、5%蛋黃粉、5%豬油、89%基礎(chǔ)飼料）120 g/d喂養(yǎng)。9周后全部進(jìn)行血脂檢測并在隨機(jī)選取模型組3只做病理觀察，確定模型建立成功后模型組隨機(jī)抽取40只分為4組，每組10只，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，其中未處理組（B組）不加藥物；低劑量水蛭組（C 組）加入水蛭粉劑量 0.5 g/（kg·d）；高劑量水蛭組（D 組）加入水蛭粉劑量 1.5 g/（kg·d）；阿托伐他汀組（E 組）加入阿托伐他汀用量2.5 mg/（kg·d）。A組全部保留并繼續(xù)普通喂養(yǎng)。繼續(xù)喂養(yǎng)8周后各組均出現(xiàn)少量死亡，飼料A、B、C、D、E組進(jìn)行入實(shí)驗(yàn)的兔分別為6、6、8、8、7只，第 8周末，所有存活兔禁食12 h后采血5～8 mL，制備血清。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]。NO、ET-1、PGF-1-α、TXB2 及 CRP 的測定方法參照試劑盒說明書操作?？偰懝檀?（TC）、低密度脂蛋白（LDL）采用全自動(dòng)生化分析儀測定。采血結(jié)束后，將所有大耳白兔處死，取胸主動(dòng)脈段大體觀察，采用LeicaQWin圖像分析系統(tǒng)匯總出斑塊面積并計(jì)算斑塊占動(dòng)脈內(nèi)皮總面積的百分比，取病變最嚴(yán)重處石蠟切片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Scheffe法。計(jì)數(shù)資料采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，組間多重比較采用Dunn法。用LeicaQWin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胸主動(dòng)脈大體標(biāo)本觀察 見圖1。A組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粉白色，表面光滑，動(dòng)脈管壁彈性良好，無一例有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊或脂質(zhì)條紋；B組內(nèi)膜表面粗糙，彌漫增厚，管壁彈性差，易于斷裂，有明顯的斑塊形成，灰白色、大小不等、相連成片，平均斑塊面積達(dá)內(nèi)膜總面積的74%；C、D、E組平均斑塊面積分別為45%、21%、20%。

2.2 胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)改變 A組血管內(nèi)膜均正常，見圖2-1。余各組均出現(xiàn)了輕、重度粥樣斑塊，見圖2-2及圖2-3，成功建立大耳白兔動(dòng)脈粥樣硬化模型。其中 B組 4例 （67%）、C組 4例（50%）、D 組 2例（25%）、E 組 1例（14%）可見典型粥樣斑塊病變。

2.3 各組血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果比較 各組TC、LDL及NO等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中D組與B組各項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.001）；D組和C組 TC、LDL、ET-1及 PGF-1-α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組和E組除TC、LDL及ET-1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P<0.05或P<0.01），其他各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

Figure 1 Macroscopic observation of thoracic aorta in five groups圖1 各組胸主動(dòng)脈標(biāo)本大體觀察

Table 1 Comparison of serological detection index between four groups表1 各組血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果比較 （±s）

Table 1 Comparison of serological detection index between four groups表1 各組血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果比較 （±s）

*P < 0.05，**P < 0.01

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Figure 2 Thoracic aorta observed by optical microscope圖2 胸主動(dòng)脈光鏡觀察（HE染色×100）

3 討論

本研究中大耳白兔動(dòng)脈粥樣硬化模型造模成功，提示高脂可損傷動(dòng)脈內(nèi)皮，并導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，其可能在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[3]。C、D斑塊面積低于B組，提示水蛭具有保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮、延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。研究發(fā)現(xiàn)，血脂中LDL被氧化后參與形成泡沫細(xì)胞，還可損傷內(nèi)皮，促進(jìn)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞黏附，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生及血小板黏附聚集，加劇炎癥反應(yīng)等，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要原因[3,5]。本研究中C、D組血清TC和LDL均低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示水蛭具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護(hù)內(nèi)皮及延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的作用。但D組的TC、LDL值均高于E組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在調(diào)節(jié)TC和LDL方面水蛭與阿托伐他汀有一定差距。

前列環(huán)素（PG）I2和血栓烷（TX）A2在體外極不穩(wěn)定，本研究中以測定其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物PGF-1-α和TXB2代替，同時(shí)測定NO和ET-1，結(jié)果顯示，C、D組與B組比較，PGF-1-α和NO升高，TXB2、ET-1降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)方面它們具有相似的作用。李慎賢等[6]研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮功能損傷在可見斑塊出現(xiàn)前很長時(shí)間已經(jīng)形成，在內(nèi)皮功能障礙時(shí)分泌的各項(xiàng)因子中以PGI2、NO降低和TXA2、ET-1升高最為顯著，其中TXA2能促進(jìn)血小板聚集，收縮血管，ET-1是強(qiáng)烈的血管收縮劑，同時(shí)可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，二者的升高可進(jìn)一步加劇病變的進(jìn)展，而PGI2和NO為兩者的拮抗因子，對內(nèi)皮細(xì)胞損傷起到一定的保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為，CRP是炎癥反應(yīng)因子，參與內(nèi)皮損傷的炎癥反應(yīng)過程，可加速動(dòng)脈硬化；CRP表達(dá)水平高低可反應(yīng)動(dòng)脈硬化程度以及斑塊的穩(wěn)定性[7-8]。本研究中D組CRP低于B組，表明水蛭能顯著降低血清中CRP水平。C、D組間CRP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而D組與E組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示水蛭可抑制炎癥反應(yīng)，作用與阿托伐他汀相似，從而改善動(dòng)脈粥樣硬化。但水蛭保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮的作用是否存在其他的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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