張 浩 付靜濤 艾君濤 段素云 曹 靖 李彥俠 李 璟 肖西山

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442）

胚胎移植是胚胎生物技術(shù)的重要組成部分，以引進(jìn)品種和品種改良為主的綿羊胚胎移植技術(shù)研究與應(yīng)用發(fā)展迅速。在國內(nèi)，綿羊胚胎移植及相關(guān)生物技術(shù)除了費用高外，移植妊娠率還不太理想，影響其推廣及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程[1]。胚胎移植是一個復(fù)雜的生理過程，涉及到胚胎、子宮內(nèi)環(huán)境以及黃體之間的一系列復(fù)雜的生理、生化指標(biāo)，其中有些已為人們所掌握，另有不少的問題尚在研究探索之中[2]。目前，盡管胚胎移植技術(shù)在綿羊的繁殖、育種中已體現(xiàn)獨特的優(yōu)越性，但由于在胚胎移植的各個技術(shù)環(huán)節(jié)上還存在諸多問題，所以本實驗通過對卵巢移植側(cè)上黃體數(shù)量對鮮胚和凍胚妊娠率影響的比較研究，為綿羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供體母羊的選擇及飼養(yǎng)管理

供體母羊為從澳大利亞引進(jìn)的純種道塞特、薩?？?、杜伯三種綿羊，年齡為1～4歲，健康，無繁殖疾病。

1.2 受體母羊的準(zhǔn)備和飼養(yǎng)管理

綿羊的受體品種為小尾寒羊；年齡2～5歲，健康，無繁殖疾?。煌诎l(fā)情前至少1個月進(jìn)行補飼。

1.3 藥品

Progestagen Sponge（孕酮海綿栓）：澳大利亞Intervet Pty.Ltd. 生產(chǎn)，0.5 g/支。

PMSG：天津?qū)嶒瀯游镏行模? 000 IU/支。

5%亞硒酸鈉維生素E注射液：亞硒酸鈉10 mg+500 IU維生素E/10 ml/支（東臺市動物藥廠，上海，批號：020405）。

1.4 受體羊同期發(fā)情

采用陰道埋置孕酮海綿栓和注射PMSG對受體羊進(jìn)行同期發(fā)情處理。

在受體羊發(fā)情周期的任意一天埋置孕酮海綿栓，第12 d注射PMSG 280 IU并同時取出海綿栓，然后觀察發(fā)情。

1.5 冷凍胚胎來源

胚胎引自于澳大利亞維多利亞省Hamilton，胚胎全部用乙二醇溶液冷凍。

1.6 胚胎解凍方法

胚胎采用二步法解凍。解凍液1：0.33M蔗糖+0.5M的EG/PBS；解凍液2：0.33M蔗糖/PBS。胚胎從液氮罐中取出，在空氣中（室溫25℃）停留10 s，在32℃水浴中10 s，將胚胎推出依次放入解凍液1和2中各5～6 min，之后在保存液中洗3～4遍后備移植。

1.7 胚胎移植方法

采用腹腔鏡法進(jìn)行移植。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SAS檢驗。

2 結(jié)果

2.1 移植側(cè)卵巢黃體數(shù)量不同對綿羊受體鮮胚移植妊娠率的影響

本實驗對綿羊受體移植側(cè)卵巢上含有1、2、3個黃體的鮮胚移植妊娠率進(jìn)行比較，結(jié)果各組間差異不顯著，但3個黃體的鮮胚移植妊娠率高于2個和1個黃體的鮮胚移植妊娠率，2個黃體的鮮胚移植妊娠率稍高于1個黃體的鮮胚移植妊娠率。詳見表1。

表1 綿羊受體移植側(cè)有1、2、3個黃體對鮮胚移植妊娠率的影響

2.2 移植側(cè)卵巢的黃體數(shù)量不同對綿羊受體凍胚移植妊娠率的影響

對移植側(cè)卵巢上含有1或2個黃體的409只綿羊受體凍胚移植妊娠率進(jìn)行比較，結(jié)果各組間差異不顯著，說明只要黃體質(zhì)量好，1或2個黃體都可以進(jìn)行移植，但2個黃體的受體移植妊娠率稍高。詳見表2。

表2 綿羊受體移植側(cè)卵巢有1或2個黃體對凍胚移植妊娠率的影響

圖1 黃體數(shù)量對受體綿羊鮮胚和凍胚移植妊娠率比較

3 討論

黃體是排卵后的卵泡形成的一個臨時性內(nèi)分泌器官，主要分泌孕酮，維持早期妊娠[3]。黃體分泌的孕酮使胚泡在適當(dāng)?shù)臅r候在子宮著床。孕酮還能阻止子宮平滑肌層的收縮，防止流產(chǎn)[4]。當(dāng)機體內(nèi)孕酮濃度較高時，可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），白血病抑制因子（LIF）及輔助性T細(xì)胞（Th）2型細(xì)胞因子[5]。孕酮可阻止有絲分裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖，延長同種異體移植物的存活時間；降低單核細(xì)胞的氧化代謝，減少巨噬細(xì)胞對細(xì)菌反應(yīng)中產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，以維持正常的妊娠環(huán)境[6]。

受體綿羊移植側(cè)黃體數(shù)量對鮮胚移植妊娠率并非越多越好，一般1～3個較好。3個黃體效果好于2個黃體，1個黃體妊娠率最低，可能與黃體分泌的孕激素含量有關(guān)。由于本實驗中4個或4個以上黃體的情況很少，移植妊娠率很低，故未進(jìn)行對比。

綿羊受體移植側(cè)黃體數(shù)量1或2個對凍胚移植妊娠率無顯著影響（3個以上黃體的受體數(shù)量很少，故未做比較），這兩種情況都可進(jìn)行移植。

本研究表明只要黃體質(zhì)量好，移植側(cè)1～3個黃體都可以進(jìn)行移植，同時進(jìn)一步量化了移植側(cè)黃體數(shù)量對鮮胚和凍胚移植妊娠率的影響。

[1] 史小林. 人類生殖學(xué)[M] . 北京：科學(xué)出版社，2001.

[2] BlandauRJ，Brackett B，Brenner RM，et al. The oviduct. In：GreepRO，Koblinsky MA，eds. FrontiersinReproduc-tionandFertility Control[M] . Cambridge，MA：MIT Press，1977.

[3] 朱杰，童先宏. 孕酮與妊娠關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志.2012，31（2）：133-136.

[4] Beagley KW，Cockel CM. Regulation of innate and adaptive immunity by the femal sex hormones oestradiol and progesterone[J].FEMS Immunol Med Microbiol，2003，38（1）：13-22.

[5] Duan L，Yan D，Zeng W，et al. Effect of progesterone treatment due to threatened abortion in early pregnancy for obstetric and perinatal outcomes [J]. Early Hum Dev，2010，86（1）：41-43.

[6] 郭淑華.哺乳動物黃體發(fā)生的分子機制[J]. 濰坊學(xué)院學(xué)報.2009，9（4）：90-93.