周 兵，張根葆，，段 婷，周 玨，吳 娟

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室;2.病理學(xué)教研室;3.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

蛇毒作為目前研究較多的一類生物毒素，其體外抗腫瘤的效果已經(jīng)得到了國內(nèi)外學(xué)者充分的證實(shí)，被認(rèn)為對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有著特異性的殺傷作用［1，2］。但由于蛇毒成分復(fù)雜，且副作用大，給今后開發(fā)利用這一生物資源帶來了不小的困難。因此分離純化蛇毒中具有高效低毒的有效成分，被認(rèn)為是蛇毒抗腫瘤工作者研究的方向。AAVC-Ⅰ為尖吻蝮蛇毒中提取的一種活性蛋白［3］。目前已經(jīng)證明其具有廣泛的抗凝血作用，但其抗腫瘤活性在國內(nèi)外報(bào)道不多［4］。因此，基于實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)蝮蛇毒組分抗腫瘤做過的研究工作為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討尖吻蝮蛇毒組分在體外抗腫瘤作用［5，6］。分離出尖吻蝮蛇毒組分-Ⅰ，觀察其對(duì)小鼠肺癌LLC細(xì)胞的增殖影響并初步探討其機(jī)制，為尋求開發(fā)高效低毒高純度的抗腫瘤新藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 AAVC-Ⅰ是本院蛇毒研究所利用皖南尖吻蝮蛇毒粗毒經(jīng)Cellulose DE-52離子交換和Sephadex G-75分子篩兩步層析后獲得的酸性蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子量約為23 ku。1640-RPMI為賽默飛世生物化學(xué)制品公司產(chǎn)品，胎牛血清(無支原體)為杭州四季青公司產(chǎn)品，四唑氮藍(lán)(MTT)試劑盒、基因組DNA抽提試劑盒、DNA-Ladder、PBS胰酶、緩沖液、雙抗(青霉素-鏈霉素)均為浙江碧云天公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng) 小鼠肺癌LLC細(xì)胞，為本院藥理實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。LLC細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞。用含10%胎牛血清、1%的雙抗的1640培養(yǎng)液置于生長環(huán)境為5%CO2、37℃的飽和濕度的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)的變化 取對(duì)數(shù)生長期的LLC細(xì)胞，調(diào)整為4×104個(gè)/ml，采用細(xì)胞爬片方法接種到六孔板，培養(yǎng)箱孵育 12 h，按照 12.5 μg/ml、50 μg/ml兩個(gè)終濃度加藥，對(duì)照組加等量生理鹽水，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育48 h，取玻片倒置顯微鏡鏡檢。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期的LLC細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞終濃度為4×104個(gè)/ml種植于96孔板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱孵育12 h。實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 μl藥物至終濃度為12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml，對(duì)照組加 10 μl生理鹽水，培養(yǎng)箱孵育24 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μl MTT溶液后繼續(xù)孵育4 h，繼續(xù)加入10 μl Formanzan 溶解液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，震蕩 5 min，570 nm處測(cè)定吸光度A值。改良寇式法計(jì)算半數(shù)抑制量IC50。

1.5 細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳 按DNA抽提試劑盒操作辦法，離心收集藥物 0 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml和等量生理鹽水處理 48 h 后的細(xì)胞。PBS 洗滌兩遍，加入4 μl RNA 酶后，20 μl蛋白酶K混勻。加200 μl樣品裂解液，70℃裂解10 min，加入200 μl混勻，PBS洗滌 2次后離心，加入60 μl洗脫液收集離心柱內(nèi)DNA，80V電壓下1%的瓊脂糖凝膠電泳2 h，凝膠成像儀下觀察DNA條帶形成并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)以SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。正態(tài)或者近似正態(tài)數(shù)據(jù)用s表示，AAVC-Ⅰ比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尖吻蝮蛇毒抑瘤組分-Ⅰ作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組LLC細(xì)胞鏡下可見呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形、條索狀貼壁生長，輪廓清楚，生長旺盛。用12.5 μg/ml、50 μg/ml藥物處理后 24 h，細(xì)胞縮小、形態(tài)變圓，胞膜卷曲、褶皺、細(xì)胞聚集、死亡(圖1)。

圖1 AAVC-Ⅰ作用24 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化a 對(duì)照組;b 12.5 μg/ml組;c 50 μg/ml組Fig 1 Morphological change of LLC cell treated for 24 hours by different dose of the drug

2.2 尖吻蝮蛇毒抑瘤組分-Ⅰ對(duì)LLC細(xì)胞的增殖的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，AAVC-Ⅰ能有效抑制LLC細(xì)胞的增值。其作用24 h后半數(shù)抑制濃度IC50值為43.823 μg/ml。并且隨著藥物濃度的加大，其抑制作用明顯上升(P＜0.05)(表1)。

2.3 尖吻蝮蛇毒抑瘤組分-Ⅰ處理后細(xì)胞DNA電泳結(jié)果 在三種濃度梯度的藥物作用LLC細(xì)胞48 h后，相對(duì)于對(duì)照組，藥物作用組DNA片段抽提電泳均可見階梯狀DNA條帶的形成(圖2)。

3 討論

肺癌是一類較為常見的惡性腫瘤，伴隨著全球工業(yè)化進(jìn)程的加快和環(huán)境污染程度的加大，現(xiàn)肺癌的發(fā)病率高居世界首位［7］。肺癌的預(yù)后極差，五年生存率僅為5% ～15%［8］。傳統(tǒng)的手術(shù)和放化療對(duì)于肺癌的治療效果未取得突破性進(jìn)展，因此，尋求新的生物學(xué)治療手段已成為肺癌研究的熱點(diǎn)，而蛇毒抗腫瘤的研究為此提供了很好的方向。

表1 AAVC-I作用LLC細(xì)胞24 h后MTT法檢測(cè)結(jié)果(n=6，±s，P＜0.05)Tab 1 AAVC-Ⅰon proliferation of LLC cells after 24-hour treatment(results of MTT detection)

表1 AAVC-I作用LLC細(xì)胞24 h后MTT法檢測(cè)結(jié)果(n=6，±s，P＜0.05)Tab 1 AAVC-Ⅰon proliferation of LLC cells after 24-hour treatment(results of MTT detection)

注:#表示與 AAVC-Ⅰ濃度 12.5 μg/ml組比較，P ＜0.05

AAVC-Ⅰ濃度(μg/ml)570 nm A值平均秩 抑制率(%)0.498 ±0.22 －12.5 0.400 ±0.01 31.04 25 0.320 ±0.03# 45.45 50 0.190 ±0.01# 66.92 HC 21.600 P 0 0.000

圖2 AAVC-Ⅰ作用LLC細(xì)胞后DNA電泳圖Fig 2 The DNA agarose gel electrophoresis of LLC cell treated with AAVC-Ⅰ

隨著蛇粗毒分離、純化技術(shù)的提高，蛇毒提取物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用日益受到人們關(guān)注。國外學(xué)者Liang Zhang等人以眼鏡蛇毒提取物ACTX-6對(duì)人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)對(duì)其有強(qiáng)效的殺傷作用［9］。Sheng-Huei Yang等人發(fā)現(xiàn)從眼鏡蛇毒中提取的CTXⅢ，對(duì)人白血病K562細(xì)胞有明顯的抑制作用［10］，張及祿等人從蝮蛇毒中分離的小分子多肽sis對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌細(xì)胞SMMC.7721和胃腺癌細(xì)胞SGc-7901均有殺傷作用［11］。與傳統(tǒng)的抗癌藥物相比，從蛇毒中分離出的抗腫瘤成分具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺滅、抑制的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞毒副作用小［12］。

本實(shí)驗(yàn)通過尖吻蝮蛇毒提取物AAVC-Ⅰ對(duì)小鼠肺癌LLC細(xì)胞研究，結(jié)果表明AAVC-Ⅰ能夠有效地抑制LLC細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)出劑量依從關(guān)系，其中24 h半數(shù)抑制量約為43.823 μg/ml。而在不同濃度作用細(xì)胞24 h后，顯微鏡下可見細(xì)胞懸浮、聚集，邊界不清，胞核固縮。瓊脂糖DNA電泳顯示明顯的DNA凋亡片段條帶。均證明 AAVC-Ⅰ對(duì)LLC細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。其機(jī)制可能是通過損害細(xì)胞的細(xì)胞膜、干預(yù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)相關(guān)基因和蛋白的高表達(dá)等方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但具體的作用機(jī)制還需要接下來進(jìn)一步深入的研究，為今后在臨床上應(yīng)用蛇毒提取物治療腫瘤提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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