鄭 宇，趙建偉，何玉仙，翁啟勇，黃 建

(1．福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建福州350013;2．福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

我國(guó)煙粉虱的發(fā)生記錄最早始于1949年(周堯，1949)，后由于外來(lái)生物B型煙粉虱入侵，在我國(guó)嚴(yán)重發(fā)生是最近十多年時(shí)間(張芝利等，2001)。福建省煙粉虱暴發(fā)始于本世紀(jì)初，開(kāi)始于福建南部地區(qū)，隨后范圍迅速擴(kuò)散(何玉仙等，2005)。本課題成員于2005和2009年對(duì)福建省煙粉虱田間種群的生物型鑒定、抗藥性監(jiān)測(cè)表明，福建省各地區(qū)煙粉虱田間種群為B生物型。對(duì)常規(guī)化學(xué)藥劑均產(chǎn)生了一定水平抗性，對(duì)煙堿類(lèi)農(nóng)藥抗性發(fā)展尤為迅速。通過(guò)抗藥性不同影響因子分析證實(shí)了化學(xué)藥劑脅迫是煙粉虱抗藥性水平迅速發(fā)展的關(guān)鍵因子(何玉仙等，2007;鄭宇等，2012)。而不同的藥劑選擇壓力(脅迫)是影響昆蟲(chóng)抗藥性水平差異的一個(gè)重要原因(唐振華等，1999)。殺蟲(chóng)劑脅迫又可能導(dǎo)致種群遺傳變化，這是由于抗性個(gè)體遷移導(dǎo)致種群間基因交流、種群遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。臧連生等(2006)和Zhang等(2004)都證實(shí)入侵我國(guó)的B型煙粉虱抗性種群與敏感種群在DNA水平上已存在明顯分化，不同抗性水平的煙粉虱種群其遺傳結(jié)構(gòu)有較大差異。

為了進(jìn)一步闡明我省煙粉虱在藥劑選擇壓力下的群體變化和進(jìn)化趨勢(shì)，從不同地理種群的遺傳特征分析可以有助于我們從群體水平來(lái)理解和分析。而昆蟲(chóng)群體中的遺傳變異或多態(tài)性最終都是其DNA序列的差異或多態(tài)性，通過(guò)DNA序列分析我們可以檢測(cè)到序列中不同堿基替換、插入和缺失等變異信息，從而在分子水平上檢測(cè)出群體及種間的多態(tài)與遺傳差異。而昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體DNA序列分析是最有效的方法之一，其中線(xiàn)粒體COI(mtDNA COI)基因進(jìn)化速度適中，一個(gè)較短的基因片段就包含從種水平乃至科水平的系統(tǒng)發(fā)育信息(Moritz et al．，1987)。在國(guó)內(nèi)外mtDNA COI基因已被用來(lái)研究煙粉虱的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，該基因差異能有效反映煙粉虱生物型的地理模式，被大量用來(lái)分析煙粉虱復(fù)合種不同地理種群的遺傳分化等(Frohlich et al．，1999;褚棟等，2005a、2005b、2006)。本課題主要利用的 mtDNA COI分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)與其它地區(qū)不同地理煙粉虱種群比較，探討福建地區(qū)煙粉虱地理種群遺傳特征，進(jìn)一步了解在環(huán)境選擇壓力下種群遺傳變異和分化趨勢(shì)，為揭示煙粉虱成功入侵并暴發(fā)成災(zāi)的原因，為煙粉虱預(yù)防、可持續(xù)控制與管理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試蟲(chóng)源

從福建省8個(gè)具有代表性的地理區(qū)域采集10份煙粉虱樣品，經(jīng)過(guò)測(cè)序確定為B型煙粉虱后，作為測(cè)定蟲(chóng)源(鄭宇等，2012)。挑選煙粉虱雌成蟲(chóng)，-20℃下用無(wú)水乙醇保存，作為煙粉虱DNA提取蟲(chóng)樣。記錄煙粉虱樣品采集時(shí)間、地點(diǎn)和寄主(表1)。

1．2 煙粉虱DNA方法提取與檢測(cè)

直接采用昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒(上海生工)提取。得到的DNA用30 μL TE溶解。用Thermo核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)其濃度和純度，并稀釋至10 ng·μL-1低溫保存待用。

1．3 PCR引物與擴(kuò)增條件

所用引物和反應(yīng)程序參照(羅晨，2002)，PCR產(chǎn)物以1．2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在伯樂(lè)紫外儀上觀察，記錄結(jié)果。引物 C1-J-2195(5＇TTBATTTTTTGGTCATCCAGAAGT3＇)和R2819(5＇CTGAATATCGAGGCATTCC3＇)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 600 bp 左右。

1．4 序列分析與數(shù)據(jù)處理

對(duì)樣品進(jìn)行了正反鏈測(cè)序。由DNAstar軟件包對(duì)樣品序列進(jìn)行分析和調(diào)整。再使用DNASP5．0軟件統(tǒng)計(jì)序列，計(jì)算單倍型多態(tài)度、核苷酸多樣性;單倍型數(shù)目等。

1．5 聚類(lèi)分析

基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型，在Mega5．0軟件中用UPGMA法構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)樹(shù)。

表1 不同煙粉虱種群的地點(diǎn)、生物型、寄主、試驗(yàn)個(gè)體數(shù)量以及采集時(shí)間Table 1 Sampling location，sample name，hosts and sampling time of B．tabaci collected from different places

2 結(jié)果與分析

2．1 福建群體與其它三個(gè)地理種群遺傳特征分析

本實(shí)驗(yàn)共分析了福建煙粉虱不同地理群體10個(gè)個(gè)體，mtDNA COI序列經(jīng)比對(duì)目的片段長(zhǎng)為592 bp。利用DNAsp5．0軟件進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)煙粉虱中共鑒定出10種單倍型，單倍型比率100．0%，單倍型多樣度Hd=1．0。變異位點(diǎn)(variable site)為26個(gè)，變異位點(diǎn)比率4．39%，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony information site)20個(gè)，變異比率為3．37%;核苷酸多樣性 pi=0．021(表 2)。

表2 煙粉虱不同地理種群的單倍型多樣性h和核苷酸多樣性piTable 2 Haplotype diversity and Nucleotide diversity of different geographical populations of B．tabaci

另外從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出符合同一地區(qū)、同一時(shí)間、樣本數(shù)較多的3個(gè)B型煙粉虱不同地理種群mtDNA COI序列，分別為埃及(EGT)，湖北(HB)和武漢(WH)，進(jìn)行mtDNA COI序列比對(duì)分析。其中埃及種群6個(gè)個(gè)體共鑒定出6種單倍型，單倍型比率100．0%，單倍型多樣度Hd=1．0。變異位點(diǎn)12個(gè)，變異位點(diǎn)比率1．36%，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)5個(gè)，變異比率0．057%，核苷酸多樣性pi=0．00676;湖北種群7個(gè)個(gè)體共鑒定出2種單倍型，單倍型比率28．6%，單倍型多樣度Hd=0．286。變異位點(diǎn)(variable site)4個(gè)，變異位點(diǎn)比率0．453%，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)0個(gè)，變異比率0%;核苷酸多樣性pi=0．0015;武漢種群6個(gè)個(gè)體共鑒定出1種單倍型，單倍型比率0．0%，單倍型多樣度Hd=0．0。無(wú)變異位點(diǎn)和變異位點(diǎn)比率，核苷酸多樣性pi=0(表2)。結(jié)果表明無(wú)論是核苷酸多樣性、核苷酸變異比率、單倍型比率、單倍型多樣性，福建地區(qū)B型煙粉虱種群數(shù)值最高，表明其遺傳多樣性最為豐富。

2．2 不同地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

不同地理種群的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)，形成了兩大枝，第一大枝由福建、武漢和湖北種群構(gòu)成;第二大枝由埃及種群組成。第一枝又分為2個(gè)小組，一組由福建和武漢種群組成，另一組由湖北種群組成。從遺傳距離看(表3)，埃及種群與其它3個(gè)地理種群距離最遠(yuǎn)，為1．194-1．911之間，而國(guó)內(nèi)3個(gè)地理種群遺傳距離比較接近，為0．005-0．202之間，種群相似度較高。以上說(shuō)明埃及群體與中國(guó)三個(gè)群體的遺傳背景有所不同，地理距離與群體的遺傳距離存在一定的相關(guān)性。另外，福建地理種群分布在國(guó)內(nèi)群體的不同分支內(nèi)，說(shuō)明其在群體遺傳結(jié)構(gòu)上較大遺傳差異，有更為豐富的遺傳多樣性。

表3 煙粉虱四個(gè)不同地理種群的遺傳距離Table 3 The genetic distance for 4 different geographical populations of B．tabaci

2．3 不同地理種群遺傳變異

對(duì)4個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(表4)，顯示60．9%的遺傳差異來(lái)自于群體間，39．1%的遺傳差異來(lái)自于群體內(nèi)，差異極顯著(P=0．000)。

表4 煙粉虱四個(gè)群體內(nèi)和群體間的變異Table 4 Variation among populations and within 4 geographical populations of B．tabaci

3 討論

本文通過(guò)對(duì)福建B型煙粉虱不同田間種群的mtDNA COI進(jìn)行測(cè)序，并與其它地理B型種群比較，結(jié)果在核苷酸多樣性、單倍型比率、單倍型多樣度等方面，福建煙粉虱種群表現(xiàn)最高，說(shuō)明福建田間種群的遺傳多樣性更為豐富，種群分化更為明顯，聚類(lèi)分析也表明福建地區(qū)的種群遺傳結(jié)構(gòu)變化較大。

我們知道煙粉虱自然種群遺傳結(jié)構(gòu)變化受多方面條件影響，除自身群體的遺傳特性外，不同生態(tài)環(huán)境條件下都可能是誘導(dǎo)煙粉虱遺傳分化的因子。Zhang等(2005)就證實(shí)寄主植物是誘導(dǎo)煙粉虱遺傳分化的重要因素，B型煙粉虱的遺傳分化與受寄主脅迫的時(shí)間和強(qiáng)度成正相關(guān)。其它環(huán)境因子如溫度等亦能影響其遺傳分化(Zhang et al．，2005;褚棟等，2006)。這些都是煙粉虱對(duì)不同生境的適應(yīng)反應(yīng)，從群體上表現(xiàn)出不同的遺傳變化。結(jié)合以往研究，近年來(lái)福建地區(qū)煙粉虱種群抗藥性水平上升十分迅速，不同地理種群抗性水平差異也較大，這與不同化學(xué)藥劑的施藥水平和脅迫壓力密切相關(guān)(鄭宇等，2012)。煙粉虱在殺蟲(chóng)劑的選擇下，抗性個(gè)體遷移導(dǎo)致種群間基因交流、種群遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。研究證實(shí)，化學(xué)藥劑的不合理使用能導(dǎo)致B型煙粉虱種群抗藥性水平迅速提高，而其種群的遺傳結(jié)構(gòu)也發(fā)生快速演變和分化。臧連生等(2006)和Zhang等(2004)都證實(shí)入侵我國(guó)的B型煙粉虱抗性種群與敏感種群在DNA水平上已存在明顯分化，不同抗性水平的煙粉虱種群其遺傳結(jié)構(gòu)有較大差異?？梢酝茰y(cè)，在福建地區(qū)煙粉虱田間種群遺傳結(jié)構(gòu)不可避免受到化學(xué)藥劑脅迫影響，而這種影響又是深刻、長(zhǎng)遠(yuǎn)的。

圖1 由COI序列得到的UPGMA系統(tǒng)樹(shù)Figure 1 UPGMA phylogenetic tree based on COI sequences

B型煙粉虱能夠在我國(guó)成功入侵并為害巨大，除了與該種群對(duì)土著種競(jìng)爭(zhēng)取代(Reitz and Trumble，2002)和生態(tài)環(huán)境(包括寄主植物、氣候因子、越冬場(chǎng)所等)的適應(yīng)能力密切相關(guān)外(Drost et al．，1998;張芝利，2000)，另一個(gè)重要影響因素就是B型煙粉虱抗藥性水平在其入侵、擴(kuò)散過(guò)程中也起到了重要的作用(Byrne et al．，2000;Riley and Tan，2002)。結(jié)合我省煙粉虱種群抗藥性監(jiān)測(cè)和抗藥性水平發(fā)展的情況(何玉仙等，2007;鄭宇等，2012)，可以推測(cè)在環(huán)境脅迫下，如殺蟲(chóng)劑壓力選擇下，我省田間煙粉虱種群開(kāi)始出現(xiàn)比較明顯的抗性遺傳分化，以適應(yīng)不利環(huán)境，這對(duì)今后我省煙粉虱防治工作是一個(gè)重要警示。

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