王 敏，李方明，劉祖明，毛貴川，陳海明，王興林，劉金偉，楊紹華

(1．黔西南州人民醫(yī)院暨遵義醫(yī)學(xué)院第七附屬醫(yī)院，貴州 興義 562400;2．遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院暨貴州省細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099;3．?？诒６悈^(qū)遠(yuǎn)兮細(xì)胞分子技術(shù)應(yīng)用研發(fā)有限公司，海南 ?？?570000)

位于染色體4q25的人表皮生長因子前體蛋白(prepro－epidermal growth factor，preproEGF)基因由24個(gè)外顯子和23個(gè)內(nèi)含子組成，全長約110 kb，其外顯子編碼一條1207個(gè)氨基酸的蛋白多肽鏈，其間含有1段(53個(gè)氨基酸)表皮生長因子，9段重復(fù)的低密度脂蛋白受體多肽，9段類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域(其中3段結(jié)構(gòu)域兼具潛在的Ca++結(jié)合位點(diǎn))，此外該蛋白還含有9個(gè)糖基化位點(diǎn)和12個(gè)位點(diǎn)的氨基酸變體。這表明preproEGF蛋白除了具有表皮生長因子的生物學(xué)功能之外，還應(yīng)具有低密度脂蛋白受體，參與出凝血機(jī)制和組成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的功能，對(duì)細(xì)胞的生長分化和組織代謝起著多方面的重要作用［1，2］。已有研究揭示preproEGF基因的遺傳變體或多態(tài)，特別是單核苷酸多態(tài)(Single nucleotide polymorphysims，SNPs)可能與冠心病、智力發(fā)育障礙和腫瘤發(fā)生等臨床病具有相關(guān)性［3，4］。研究同時(shí)也表明分布在 preproEGF基因第61 bp位點(diǎn)的SNP(A/G)與歐美人某些腫瘤例如黑色素瘤等之發(fā)生具有相關(guān)性［5］。可見深入探索鑒定SNPs在preproEGF基因中的分布情況及其特點(diǎn)頗具醫(yī)學(xué)遺傳價(jià)值。理論上講SNPs以平均千分之一個(gè)單核苷酸的機(jī)率發(fā)生和分布在整個(gè)基因組序列之中，但有研究顯示在編碼基因內(nèi)只有少數(shù)(約1/3)的SNPs分布，而且有些SNPs是以稍微富集成串叢簇的方式散布于人基因組全序列之中［6，7］。然而，基因組 SNPs的這些分布特點(diǎn)對(duì)其在單個(gè)基因序列內(nèi)的分布是否同樣如此尚不清楚。我們報(bào)道了SNPs在preproEGF基因第20和21外顯子及其內(nèi)含子區(qū)段分布未見其富集成串叢簇的特點(diǎn)，但見其1～2個(gè)SNPs散布于約4．5kb 大片段內(nèi)的稀疏分布現(xiàn)象［8］;至于 preproEGF基因其余區(qū)段的SNPs分布狀況，尚需進(jìn)一步的探索研究。目前業(yè)已完成的人類基因組計(jì)劃和第二代國際人類基因組單體型圖譜為深入探尋SNPs在各基因序列內(nèi)部的分布提供了充分有力的遺傳信息支撐和資料數(shù)據(jù)保障［9，10］。本研究擬應(yīng)用生物信息技術(shù)對(duì)preproEGF基因的DNA序列進(jìn)行檢索分析，為進(jìn)一步的基因遺傳學(xué)研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供一個(gè)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 preproEGF基因DNA序列～110 kb。

1．2 主要儀器和材料資源 計(jì)算機(jī)(聯(lián)想公司)，電訊寬帶網(wǎng)路(中國電訊)，NCBI的生物信息技術(shù)程序和dbSNP。

1．3 方法 從電訊寬帶登錄網(wǎng)址www．nlm．nih．gov，打開NLM主頁并經(jīng)PubMed/MEDLINE轉(zhuǎn)到SNP項(xiàng)，點(diǎn)擊可進(jìn)入 dbSNP Home Page，然后經(jīng)Blast和Entrez SNP即可檢索到preproEGF基因的dbSNP并對(duì)其進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

經(jīng)Blast和Entrez SNP檢索到在4號(hào)染色體及preproEGF基因的DNA序列中分布有93個(gè)參照SNPs(reference SNP，RefSNP)和 51個(gè)亞 SNPs(subset SNP);這些SNPs或以單一SNP(RefSNP)或以多個(gè)SNPs(RefSNP+亞SNP)分別分布于從6651bp到810bp大小不等的各基因片段中;同時(shí)本研究計(jì)算了各基因片段之間和之內(nèi)的相鄰SNPs間之平均距離(bp)?，F(xiàn)將這些數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見表1)。

表1 SNPs在染色體preproEGF基因中的分布情況

(續(xù)表)

(續(xù)表)

(續(xù)表)

由列表之?dāng)?shù)據(jù)可見SNPs在基因序列中的分布大致表現(xiàn)出如下特征:①平均1/1000的分布密度;②成串叢簇聚集分布;③不均等散布。

3 討論

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)存在于preproEGF基因DNA序列內(nèi)的SNPs進(jìn)行了檢索分析。結(jié)果顯示這些SNPs共計(jì) 144個(gè)，其中93個(gè)為RefSNPs(rs)，51個(gè)為亞SNPs(侯選SNP或candidate SNP)。從列表之?dāng)?shù)據(jù)可見，絕大多數(shù)(約99%)的SNPs位于人的第4號(hào)染色體DNA序列中，僅第100號(hào)rs61691240和第133號(hào)rs11098054可能位于第7號(hào)染色體上。進(jìn)一步分析揭示:首先，在93個(gè)RefSNPs中有占比約53﹪的49個(gè)分別分布在1200 bp～800 bp(平均1000 bp或1 kb)長的各DNA區(qū)段內(nèi)，即分布密度約為千分之一(1/1000)?？梢?，僅約二分之一的RefSNPs在preproEGF基因的分布與其理論分布相吻合，這就意味著其余二分之一RefSNPs分布在preproEGF基因有另外的形式。其次，以至少3個(gè)以上的SNPs聚集，且相鄰SNPs之間平均距離短于200 bp(＜200 bp)作為其富集成串叢簇的指標(biāo)，在列表中就可見到有相鄰SNPs之間平均距離分別為155、154、102、62、55、43 和 41bp 的 7 段 RefSNP 富集區(qū)，其平均間距分別為15和9bp的兩段亞SNP富集分布之基因片段;還可見各富集區(qū)段SNP數(shù)目彼此各不相等，其中154 bp或9 bp富集區(qū)段分別含有6或22個(gè)SNPs，各自為RefSNP類或亞SNP類富集區(qū)段中含SNPs最多的DNA區(qū)段或基因片段。很顯然，這是SNPs在preproEGF基因中分布的另一種形式或特點(diǎn)，對(duì)于該基因及其相關(guān)疾病研究的課題設(shè)計(jì)具有重大的指導(dǎo)參考價(jià)值。第三，如果順序觀察編號(hào)SNPs，不難發(fā)現(xiàn)其中的第001～004、016 ～019、039 ～040、042 ～046、051 ～052、054、056 ～057、059 ～ 060、062、064 ～ 065、067～068、070～071、073～074和121～126號(hào)共37個(gè)SNPs雖已達(dá)一定總數(shù)占比(約26﹪)，但其即不具備密度為1/1000的SNPs分布特征也不符合至少3個(gè)或以上的SNPs成串聚集和相鄰SNPs之間的平均距離短于200 bp(＜200 bp)的富集成簇指標(biāo)，因而只能將其另類為不均等散布于preproEGF基因DNA序列中之SNPs(不均等散布的SNPs)?？梢娺@是SNPs在preproEGF基因內(nèi)分布的又一特別之處。總之，SNPs在preproEGF基因DNA序列中的分布明顯表現(xiàn)出多數(shù)以平均1/1000的分布密度;部分RefSNPs和少數(shù)亞SNPs富集成串叢簇聚集;另有占總數(shù)約26﹪的SNPs呈不均等散布的特征。這些特征比其SNPs在人類基因組全序列中的分布明顯有所不同［6］，這對(duì)于指導(dǎo)進(jìn)一步的研究設(shè)計(jì)頗具獨(dú)特的參考價(jià)值和深遠(yuǎn)影響。另一方面，這些分布特征對(duì)于指導(dǎo)設(shè)計(jì)具體的探索性實(shí)驗(yàn)可增強(qiáng)其針對(duì)性，減少其盲目性，避免不必要的重復(fù)實(shí)驗(yàn)并提高工作效率，對(duì)于加速研究工作的順利完成具有十分重要的意義。

基因組范圍相關(guān)性研究中，已有報(bào)道至少有800個(gè)SNPs與疾病的發(fā)生相關(guān)，不過其中約占總數(shù)81%的650個(gè)SNPs并不分布在基因的編碼序列，而是分布在基因的內(nèi)含子和各基因之間的DNA 序列中［11，12］。與此情況相類似，preproEGF基因第20和21外顯子及其內(nèi)含子(第20內(nèi)含子)區(qū)段的研究也證實(shí)該區(qū)段僅有的2個(gè)SNPs，且全都分布于內(nèi)含子區(qū)段，這與其它基因組相關(guān)性研究的結(jié)果相似。

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