嚴(yán)優(yōu)芍，鐘偉健，孫 悅（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 510006；.廣州市公安司法鑒定中心，廣州510030）

浙貝母為百合科植物浙貝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鱗莖，具有清熱化痰、止咳、開郁、散結(jié)之功，是一種常用的化痰中藥。中醫(yī)理論認(rèn)為，痰在腫瘤的形成機(jī)制中占有重要的地位，故在治療腫瘤的處方中經(jīng)?？梢娬阖惸傅膽?yīng)用?，F(xiàn)代研究表明，浙貝母具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用，其主要有效成分為生物堿[1，2]。筆者采用響應(yīng)面法對浙貝中總生物堿的超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，為進(jìn)一步研究浙貝母奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；SK8200LHC超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）。

浙貝母（廣東省藥材公司中藥飲片廠，批號(hào)：20101210）；貝母素乙對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110751-200608）；水為重蒸餾水，乙醇、鹽酸、氨水、氯仿、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、溴麝香草酚藍(lán)等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的貝母素乙對照品2.52 mg，置于25 mL量瓶中，加氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取浙貝母粉末5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入適量75%乙醇，超聲（頻率：53 kHz）至一定時(shí)間，取出，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%的鹽酸分次溶解，濾過，濾液用氨水調(diào)pH值為11，氯仿萃取3次，每次20 mL，合并萃取液于100 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察[3，4]精密吸取貝母素乙對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于分液漏斗中，分別加氯仿使成25 mL，再加pH 5.0的苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液2 mL和0.001 mol·L－1的溴麝香草酚藍(lán)溶液2 mL，強(qiáng)力振搖，靜置待完全分層，分取氯仿層于已加入0.25 g無水硫酸鈉（105℃干燥4 h）的25 mL干燥量瓶中，密塞，搖勻。隨行空白對照，在410 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，貝母素乙檢測濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.0517+0.0311c（r＝0.9996，n＝5）。結(jié)果表明，貝母素乙檢測濃度在4.032～20.160 mg·L－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 樣品含量測定 精密吸取供試品溶液5 mL，置分液漏斗中，按“2.1.3”項(xiàng)下“加氯仿使成25 mL”起操作。隨行空白對照，在410 nm波長處測定吸光度，代入回歸方程計(jì)算含量，并按下式計(jì)算總生物堿得率：總生物堿得率＝[（A－0.0517）×V×N]/（0.0311×W×106）×100%。式中，A為吸光度；V為樣品溶液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；W為取樣量（g）。紫外吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜Fig 1 UV spectra

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間的選取 精密稱取浙貝母粉末5份，每份5 g，各加入20 mL75%乙醇，置超聲儀（功率：400 W，頻率：53 kHz）中分別處理15、30、45、60、75 min，濾過，濾液按“2.1”項(xiàng)下方法測定總生物堿含量，并計(jì)算總生物堿得率。結(jié)果，當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)總生物堿得率最大，之后隨提取時(shí)間增加得率反而緩慢下降，具體影響見圖2A。

圖2 各因素對浙貝母中總生物堿得率的影響Fig 2 Effects of each factor on the yield of total alkaloid from F.thunbergii

2.2.2 超聲波功率的選取 精密稱取浙貝母粉末5份，每份5 g，各加入20 mL75%乙醇，分別置超聲儀中以不同功率（頻率恒定為53 kHz）處理45 min，濾過，濾液按“2.1”項(xiàng)下方法測定總生物堿含量，并計(jì)算總生物堿得率。結(jié)果，總生物堿得率在超聲波功率達(dá)到400 W之前隨著功率的升高而增加，但在超聲波功率＞400 W后，總生物堿得率明顯下降，具體影響見圖2B。

2.2.3 液料比 精密稱取浙貝母粉末5份，每份5 g，分別加入20、25、30、35、40 mL75%乙醇，置超聲儀（功率：400 W，頻率：53 kHz）中處理45 min，濾過，濾液按“2.1”項(xiàng)下方法測定總生物堿含量，并計(jì)算總生物堿得率。結(jié)果，隨著液料比的增大，總生物堿得率隨之提高。但當(dāng)液料比＞6（mL∶g）時(shí)，總生物堿得率有下降趨勢。由于液料比過大，溶劑用量和下一步濃縮工藝的能耗都會(huì)增加，因此初步確定液料比為6（mL∶g），具體影響見圖2C。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)選超聲波提取工藝

通過單因素試驗(yàn)可初步確定提取時(shí)間、超聲波功率、液料比3個(gè)參數(shù)的量，在此基礎(chǔ)上采用3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)。因素水平見表1（每個(gè)因素的低、中、高水平分別記作－1、0、1）；試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Tab 2 Scheme and the results of Box-Behnken experiment design

方案中試驗(yàn)號(hào)1～12為析因點(diǎn)試驗(yàn)，而13～15為零點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)結(jié)果以總生物堿得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到浙貝母中總生物堿得率（Y）對提取時(shí)間（A）、超聲波功率（B）和液料比（C）的二次多項(xiàng)回歸模型：Y＝0.17+0.006A+0.007B+0.007C－0.0003AB－0.002AC－0.001BC－0.010A2－0.021B2－0.012C2（r＝0.9948），表明響應(yīng)值Y的實(shí)際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度。方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表3可知，模型整體達(dá)極顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著，表明該二次方程模型比較顯著，該方程對試驗(yàn)擬合較好，可以對不同條件下的浙貝母中總生物堿得率進(jìn)行預(yù)測。A、B、C、A2、B2、C2為極顯著因素（P＜0.01），它們對總生物堿得率有極顯著影響；而AB、AC、BC三項(xiàng)的P值均＞0.05，說明各因素之間的交互作用不顯著。經(jīng)軟件優(yōu)化，當(dāng)A＝0.2、B＝0.2、C＝0.3時(shí)，可使回歸方程中Y值最大：0.1696。通過編碼值與非編碼值之間的換算，可得浙貝母中總生物堿超聲波提取最佳工藝為提取時(shí)間48 min、超聲功率420 W、液料比6.6（mL∶g），在此條件下，總生物堿得率為0.1696%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，按上述最佳工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。結(jié)果，平均總生物堿得率為0.1685%，與理論預(yù)測值的相對誤差為0.65%，預(yù)測值與試驗(yàn)值之間良好的擬合性證實(shí)了該模型的有效性。

3 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)多采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化浙貝母的提取工藝。與正交設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面法在試驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中，可以連續(xù)地對試驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，而正交試驗(yàn)只能對一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。同時(shí)，響應(yīng)面法通過中心組合試驗(yàn)，可研究幾種試驗(yàn)因素間的交互作用，求得高精密度的回歸方程。因此，該方法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中具有一定優(yōu)勢，目前在中藥研究中的應(yīng)用也日益廣泛。

筆者在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)選浙貝母中總生物堿超聲波提取工藝，通過擬合方程得到浙貝母中總生物堿超聲提取的最佳條件；且回歸分析結(jié)果表明，回歸模型極顯著，驗(yàn)證值和預(yù)測值吻合較好，說明模型預(yù)測可靠，可用于浙貝母中總生物堿超聲波提取工藝的優(yōu)選。

[1]胡凱文，陳信義.中藥活性成分抗耐藥腫瘤細(xì)胞體外篩選研究[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1998，2：10.

[2]胡凱文，鄭洪霞，齊 靜，等.浙貝母堿逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥的研究[J].中華血液學(xué)雜志，1999，20（12）：650.

[3]朱治富，李國元，趙 成.酸性染料比色法測定烏貝散中浙貝總生物堿的含量[J].安徽醫(yī)藥，2003，7（3）：222.

[4]劉喜綱，劉翠哲，常金花.應(yīng)用酸性染料比色法測定總生物堿的含量[J].中國藥房，2007，18（11）：875.