舒志芬，劉 晨，張海清

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128)

株兩優(yōu)819是株1S和華819所配制的兩系雜交組合。其母本株1S配合力強(qiáng)，至2008年已配制并通過省級、國家級審定的雜交早稻組合有28個(gè)，其中株兩優(yōu)02、株兩優(yōu)819、株兩優(yōu)30被評為省或國家廣適型超級雜交早稻組合，具有廣闊的推廣前景［1～3］。株1S所配雜交組合制種產(chǎn)量雖高(大面積制種產(chǎn)量達(dá)3 750 kg/hm2)，但連續(xù)幾年來普遍反映所生產(chǎn)雜交種子發(fā)芽率較低，常給種子生產(chǎn)者和用種者帶來一定損失［4］。付愛斌等［5］認(rèn)為，陸兩優(yōu)996制種種子適宜收獲期在母本終花后第14～17天，該時(shí)期收獲的種子籽粒飽滿，成熟完全，物質(zhì)積累充分，發(fā)芽率(勢)高，種子電導(dǎo)率低，POD、CAT活性強(qiáng)，種子活力高。王仁祥等［4］研究表明，株兩優(yōu)02和株兩優(yōu)819制種適時(shí)收獲期分別為母本終花后第11～16天、第12～17天。但上述試驗(yàn)都是在自由授粉條件下以獲得的種子批為研究對象，由于母本始花至終花需要經(jīng)歷較長時(shí)間，自由授粉會(huì)導(dǎo)致同一株母本不同小花接受花粉的時(shí)間差別較大，進(jìn)而導(dǎo)致同一批收獲的種子其成熟度可能存在較大差異，因而不能客觀反映種子本身的成熟度對種子活力的影響。筆者及課題組以株1S為母本、華819為父本，將用于制種的父母本進(jìn)行隔離避免其自由授粉，在盛花期對母本進(jìn)行集中授粉，以保證同批收獲的種子成熟度一致，進(jìn)而對不同收獲期的種子千粒重、發(fā)芽率、SOD酶及POD酶活性、外滲電解質(zhì)(H+、K+、可溶性糖)含量、淀粉含量等進(jìn)行測定，在保證種子發(fā)芽率和種子活性的情況下，以此確定株兩優(yōu)819種子的最佳收獲期，旨在為大田生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試雜交種為株兩優(yōu)819，母本為株1S，父本為華819。親本種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.2 田間制種

制種于2011年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安教學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行。父本先播，母本于父本播后8 d播種，父母本行比2∶12，父母本分別于4.5葉齡左右移栽，母本每穴2～3株秧苗，株行距15 cm×20 cm。父本大雙行移栽，兩行間35 cm，株距15 cm，每穴5株，父母本間20 cm。母本見穗35%時(shí)，連續(xù)2 d噴施“九二O”共240 g/hm2，并用薄膜將母本包圍與父本隔離，并在之后的第7天開始連續(xù)集中2 d人工授粉(9:00開始每間隔半小時(shí)授1次粉至16:00，次日重復(fù)操作)。母本授粉后的第10天起，連續(xù)16 d每2 d收獲1期種子，干燥至12.5%含水量，低溫貯藏備用。

1.3 千粒重測定

取1 000粒種子，稱出其重量，重復(fù)3次，取平均值。

1.4 發(fā)芽率測定

發(fā)芽床用濾紙做床紙，將兩片濾紙用蒸餾水浸透，放入無菌的發(fā)芽盒中，平放至濾紙間無氣泡。水稻種子在常溫下浸種24 h后，置于墊有兩層吸水紙的發(fā)芽盒中，每次取100粒種子，重復(fù)3次，置于30℃恒溫光照發(fā)芽箱內(nèi)培養(yǎng)，每天對發(fā)芽種子計(jì)數(shù)，至第7天結(jié)束，計(jì)算發(fā)芽率。

1.5 保護(hù)酶系活性測定

1.5.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

酶液提取:取1.0 g吸脹種子，用液氮研磨成粉，加入5倍于樣品量的酶提取液0.2 mol/L磷酸二氫鈉在冰浴上研磨成勻漿。將勻漿在4℃下以12 000 r/min離心20 min，取其上清液。

蛋白質(zhì)定量:用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測定酶粗提取液的蛋白質(zhì)含量。

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取6支具塞試管，分別編號(hào)0～5，加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和蒸餾水。向各支試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G－250溶液，搖勻，放置5 min左右，在595 nm下比色測定吸光值。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)樣品標(biāo)定:稱取0.5 g樣品，用5 mL蒸餾水或緩沖溶液研磨成勻漿后，以10 000 r/min離心10 min，吸取樣品上清液1.0 mL，放入具塞試管中，每個(gè)樣品重復(fù)2次，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G－250溶液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，測定吸光值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。

式中:c—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量(μg);VT—提取液總體積(mL);VS—測定時(shí)加樣量(mL);mF—樣品質(zhì)量(g)［8］。

酶活性的測定:取透明度好、質(zhì)地相同的試管2支，一支為對照組，將兩支試管中按比例(1∶1∶1)加入13 mmol/L甲硫氨酸溶液、75 μmol/L NBT溶液、10 μmol/L EDTA －Na，混合后，依次加入適量 20 μmol/L核黃素溶液和酶液，給對照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙?zhí)妆芄?，反?yīng)10～20 min，結(jié)束后，用黑布罩上試管，終止反應(yīng)。以遮光的對照管作為空白，用分光光度計(jì)在560 nm波長下測定各管的吸光值，計(jì)算SOD活性。

式中:A0—遮光對照管的吸光值;AS—樣品管的吸光值;VT—樣液總體積(mL);V1—測定時(shí)樣品用量(mL);mF—鮮樣品質(zhì)量(g);c—粗酶液中的蛋白質(zhì)含量(mg/g)［7］。

1.5.2 過氧化物酶(POD)活性測定

粗酶液的提取:稱取1.0 g浸種3 d后的水稻種子，用9 mL pH=7.0的磷酸緩沖溶液研磨并轉(zhuǎn)移至離心管，于4 000 r/min離心15 min，收集上清液保存在冷處，所得殘?jiān)儆昧姿峋彌_液提取1次，合并兩次緩沖液，保存在4℃冰箱中。

酶活性的測定:每個(gè)樣準(zhǔn)備兩個(gè)試管，測定管和對照管。測定管中依次加入2.9 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液、1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的H2O2、1.0 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚以及0.1 mL樣本上清液。反應(yīng)體系加入酶液后，立即于37℃水浴15 min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，在470 nm下測量每分鐘吸光度變化值，以表示酶活性大小。對照管中用蒸餾水代替樣本上清液作為對照。3次重復(fù)，計(jì)算POD酶活性。

結(jié)果計(jì)算:以每分鐘OD470變化0.01為一個(gè)活性單位。

式中:ΔOD470—每分鐘底物溶液吸光值的變化;m—材料質(zhì)量(mg)［7］。

1.6 外滲電解質(zhì)的測定

1.6.1 K+的測定

取0.190 7 g的KCl(110℃烘2 h)溶于無離子水中，定容至1 L。吸取 100 ppmKCl標(biāo)液 2、4、6、8、10、12 mL于50 mL容量瓶中，用水定容。在火焰分光光度計(jì)上測定K+含量，制作K+標(biāo)準(zhǔn)曲線。取水稻種子5 g用無離子水25 mL浸種4 h后，吸取待測液2.5 mL定容至25 mL，取浸種液噴入火焰，記錄火焰光度計(jì)指針讀數(shù)，重復(fù)3次，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的 K+的濃度［7］。

1.6.2 H+的測定

取5 g種子浸在25 mL無離子水中4 h，取其浸種液，把酸度計(jì)兩電極放入盛有浸種液的燒杯中，混合均勻，讀出浸種液的 pH［7］。

1.6.3 可溶性糖外滲量的測定

(1)200 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取AR級D－葡萄糖200 mg，加蒸餾水定容至1 000 mL。

(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取6支試管編號(hào)1、2、3、4、5、6，分別在 6 支試管中加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，加水 2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 mL。然后在每支試管中加入0.5 mL蒽酮試劑，再用移液管加入5 mL濃H2SO4，搖勻，反應(yīng)10 min，在620 nm波長下比色，測定各管的吸光值。

(3)吸取2 mL浸種液于大試管中，加入0.5 mL蒽酮試劑，再用移液管加入5 mL濃H2SO4，搖勻，反應(yīng)10 min，在620 nm波長下比色，測定各管的吸光值。

(4)根據(jù)所測得光密度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出糖含量(μg)，計(jì)算浸種液的可溶性糖含量?？扇苄蕴菨舛?μg/mL)為查圖所得糖含量(μg)/2 mL［7］。

1.7 淀粉含量的測定

(1)淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支試管編號(hào) 1 ～6，分別加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)液。然后分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL 蒸餾水，搖勻，則每管依次含淀粉 0、40、80、120、160、200 μg。

向每支試管中加入0.5 mL蒽酮試劑，再沿管壁加5.0 mL濃H2SO4，塞上塞子，微微搖動(dòng)，促使乙酸乙酯水解，當(dāng)管內(nèi)出現(xiàn)蒽酮絮狀物時(shí)，再劇烈搖晃促進(jìn)蒽酮溶解，然后立即放入沸水浴中加熱10 min，取出冷卻。

在分光光度計(jì)上625 nm波長下比色，測出各管的吸光度。

以吸光度值為橫坐標(biāo)，淀粉含量為縱坐標(biāo)，繪制淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線求得直線回歸方程。

(2)樣品淀粉含量測定

將種子放于70～80℃的烘箱中烘至恒溫，將種子磨成粉末，稱取50 mg，倒入10 mL試管中，加4 mL80%乙醇水浴鍋中不斷攪拌40 min，冷去后離心，倒掉上清液。再加2 mL80%的乙醇重新提取2次，過濾，將殘?jiān)娓伞?/p>

將干燥的殘?jiān)?，移?0 mL容量瓶中，加20 mL蒸餾水，放入沸水浴中加熱15 min，再加入2 mL9.2 mol/L HClO4提取15 min，冷卻后用蒸餾水定容、搖勻。

用濾紙過濾，濾液用來測定淀粉含量。

吸取濾液0.5 mL放入小試管中加1.5 mL蒸餾水，加0.5 ml蒽酮試劑，然后沿管壁加5.0 mL濃H2SO4，塞上塞子，微微搖動(dòng)，促使乙酸乙酯水解，當(dāng)管內(nèi)出現(xiàn)蒽酮絮狀物時(shí)，再劇烈搖晃促進(jìn)蒽酮溶解，然后立即放入沸水浴中加熱10 min，取出冷卻，測出樣品在625 nm波長下的吸光度，通過直線回歸方程計(jì)算淀粉的含量［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同收獲期種子千粒重、發(fā)芽率和淀粉含量比較

從表1可以看出，授粉后第10～26 d收獲的種子，隨著種子成熟度的提高，種子的千粒重、發(fā)芽率與淀粉含量逐步升高，至第8期達(dá)到最高，分別為20.67 g、96.33%、54.74 μg/g，而第 9 期略有下降。說明在第8期(授粉后第23～24 d)收獲的種子活力最高，第8期以前的種子仍在進(jìn)行物質(zhì)積累，沒有達(dá)到完全成熟，而第9期收獲的種子成熟過度，可能發(fā)生物質(zhì)淋溶情況，其淀粉含量、千粒重和發(fā)芽率均出現(xiàn)下降趨勢。

表1 不同收獲期種子千粒重、發(fā)芽率和淀粉含量比較

2.2 SOD酶活性與POD酶活性

從圖1看出，第1期至第8期收獲的種子SOD酶活性呈現(xiàn)出緩慢增長的趨勢，在第8期酶活性達(dá)到最高，第9期略有降低。不同收獲期的種子POD酶活性總體呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，第1期至第4期收獲的種子POD酶活性較低，第4期后收獲的種子POD酶活性快速增加，至第8期收獲的種子POD酶活性達(dá)到最高。由此可見，第8期收獲的種子抗逆性較強(qiáng)，種子活力高。

圖1 不同收獲期種子SOD酶與POD酶活性比較

2.3 外滲電解質(zhì)

從圖2可知，第1期至第8期收獲的種子，其外滲溶液中K+濃度總體上呈現(xiàn)出下降趨勢，但是在第9期收獲的種子其濃度稍有上升，說明成熟度差的種子細(xì)胞完整性差、透性大，浸泡液中低分子物質(zhì)含量較多，因而外滲電解質(zhì)濃度高。隨著種子成熟度的提高，種子的外滲電解質(zhì)濃度逐漸降低。在第9期收獲的種子成熟過度，導(dǎo)致收獲的種子細(xì)胞膜受損，K+濃度略有上升。

第1期至第7期收獲的種子pH值呈現(xiàn)上升的趨勢，即外滲電解質(zhì)溶液中H+濃度呈現(xiàn)下降趨勢，但第8期與第9期收獲的種子pH值呈現(xiàn)下降趨勢，即H+濃度開始增加，說明第7期與第8期收獲的種子細(xì)胞完整性好，種子活力高。

圖2 不同收獲期種子外滲電解質(zhì)及可溶性糖濃度比較

2.4 可溶性糖含量比較

隨著種子成熟度的增加，種子中的可溶性糖會(huì)不斷轉(zhuǎn)換成不溶性的淀粉貯藏在種子中。從圖2還可以看出，第1期至第4期收獲的種子的可溶性糖含量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，第5期收獲的種子可溶性糖含量快速下降，之后收獲的種子可溶性糖含量保持穩(wěn)定，但是在第9期收獲的種子其含量呈現(xiàn)略微增加。

3 小結(jié)與討論

研究結(jié)果表明，在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9個(gè)收獲期內(nèi)，以第8期收獲的種子發(fā)芽率最高，其種子的千粒重和淀粉含量也最高，說明在此時(shí)期收獲的種子成熟度高，物質(zhì)積累充分。從酶活性測定結(jié)果來看，在第8期收獲的種子SOD酶與POD酶活性最高。種子的外滲電解質(zhì)濃度與種子的活力呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，第8期收獲的種子的外滲電解質(zhì)濃度較低，種子細(xì)胞膜的完整性好，透性小，這期間收獲的種子具有較高的活力。因此，株兩優(yōu)819制種在第1至第7期收獲的種子未完全成熟，處于物質(zhì)逐漸積累和種子活力逐步提高的階段，至第8期收獲的種子已經(jīng)成熟完全，種子的千粒重和淀粉含量達(dá)到最高，種子發(fā)芽率也達(dá)到最高，種子活力和抗逆性最強(qiáng)。第9期收獲的種子成熟過渡，出現(xiàn)物質(zhì)外滲現(xiàn)象，種子活力下降，發(fā)芽率降低。說明株兩優(yōu)819制種最佳的收獲期是在第8期，即母本授粉后第23～24 d。

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