【作 者】向秋靜，李晶，劉蘋，孫建奇

1 上海交通大學生命科學技術學院，上海，200240

2 上海交通大學生物醫(yī)學工程學院和MED-X研究院，上海，200030

0 引言

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤。2008年世界衛(wèi)生組織對各種疾病死亡的統(tǒng)計結果顯示，乳腺癌在高收入國家中位于前十位。 早期發(fā)現(xiàn)，改善乳腺癌結果和提高生存率，仍然是乳腺癌控制的基石[1]。

由于實驗觀察到在沒有血管新生條件下腫瘤生長受到限制，F(xiàn)olkman最早提出了血管依賴性理論[2-3]。進一步有實驗證明，腫瘤惡變與血管新生之間有某種聯(lián)系[4]如腫瘤內微血管網絡與腫瘤發(fā)生、生長和轉移間的關系[5-8]。越來越多的研究表明，瘤內微血管網絡的密度[9]、彎曲度[10-11]、分叉類型[12]和分形維度(Fractal dimesion,FD)[13-14]等指標能夠有助于區(qū)分正常血管和腫瘤血管。隨著成像技術的發(fā)展，同步輻射光源的產生解決了傳統(tǒng)的血管造影術分辨率不高的問題[15-16]，其對離體腫瘤內微血管網絡成像分辨率可達幾十mm或更小[17-20，30]，能夠獲取較為完整的腫瘤微血管網絡。這樣為接下來通過數字圖像處理技術定量分析腫瘤微血管網絡結構提供了可能。本文針對腫瘤微血管的異常形態(tài)和成像所得到的龐大數據量，設計了分塊加載的雙閾值分割方法進行定量前的準備。

目前，微血管密度度(Microvessel densitl，MVD)和腫瘤分級是臨床常用的指導腫瘤治療的定量指標。大量研究指出，乳腺腫瘤的MVD越高意味著較高的復發(fā)率和較低的生存率[9，21-23]。另外，通過活體顯微成像手段觀測實體惡性瘤內部新生血管，可得出這樣的結論：高度紊亂、纏繞呈囊狀、分布高度不均勻、血管間距變化大、異常彎曲和擴張、旁通、閉環(huán)、過度分叉和混亂分流[24-27]。對于腫瘤血管網絡這種混亂的結構來說，分形的采用恰好彌補了歐式幾何無法描述復雜無規(guī)則物體描述的缺陷。它用單一數值（分形維度）描述不規(guī)則物體的復雜度，同時也反映出該物體的生長類型[13]。然而目前關于分形的運用大都集中于2D平面上[28-29]。有別于以前大部分針對2D圖像進行的分形分析，Laurent Risser實驗小組進行同步CT成像的腫瘤模型的分形分析，得到小鼠模型的神經膠質瘤的FD為1.9到2.2之間，明顯高于對照組的結果[30]。

本文基于同步輻射的CT吸收成像，提取5個不同生長時間點的腫瘤內微血管網絡，采用自主設計的分塊加載雙閾值方法進行大數據量三維血管的分割，并對隨時間增長腫瘤內微血管網絡的變化，結合觀察結果和定量指標（MVD和FD）進行初步分析。

1 材料和方法

1.1 樣品準備

5周齡BALB/c雌性裸鼠(購買于上海西普爾必凱實驗動物公司)，飼養(yǎng)于IVC獨立鼠籠中，整個環(huán)境嚴格消毒并人工控制12小時晝夜變換光照。裸鼠自由攝取鈷60輻射滅菌飼料及高溫滅菌水。用DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)鼠源4T1乳腺癌細胞于37oC、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內，細胞貼壁生長，呈相互連接的片狀。細胞達80%-90%密度時，等量培養(yǎng)基終止后離心，去上清，PBS重懸成細胞懸液，細胞計數為3×106個/ml，冷凍待用。取0.1 ml細胞懸液分別注入小鼠右側股部背側皮下。

接種后待小鼠清醒后放回專用無菌鼠籠中喂養(yǎng)，提供滅菌后的鼠糧和水，并且定期對鼠籠進行殺菌清潔。待腫瘤接種一定時間后，進行血管灌注和離體腫瘤樣本的采集。實驗共分為5個時間點，分別為20 d、25 d、30 d、35 d和40 d，每個時間點為3個樣本。腫瘤血管灌注采用常見的研究微循環(huán)的造影劑microfil（Flow Tech Inc.）。經反復實驗論證，較傳統(tǒng)造影劑硫酸鋇能到達更細小的微血管。灌注過程中用到實驗室自主設計的雙點滴灌注系統(tǒng)，使用0.016g/ml的戊巴比妥鈉溶液，按0.5 ml/100g小鼠體重的比例將小鼠麻醉后，仰臥固定，從劍突至恥骨聯(lián)合開口后，仔細打開胸腔。用0.6×0.25 mm靜脈注射針自心尖扎入左心室，先用40U/ml肝素生理鹽水灌注5 min，然后用福爾馬林溶液灌注5 min，之后勻速推入microfil 大約5 ml。4oC冰箱過夜后，取出腫瘤組織用于成像。

1.2 成像

將灌注后的離體腫瘤放于特制的樣品臺上，利用上海光源X 射線成像及生物醫(yī)學應用光束線站（BL13W）的同步輻射系統(tǒng)進行離體腫瘤樣本的CT成像，使用的探測器最小分辨率為9 mm，探測器距光源為25 cm，能量為20 kev。每個樣本共獲1200CT張斷層圖，每張斷層拍攝角度步進速度為（180/1200）度/張，需時約15 min。得到腫瘤組織新生血管的三維斷層圖像后。利用常規(guī)濾波反投影算法對投影數據進行重建，最終的斷層圖轉換為8位無壓縮tif數據格式進行存儲，由于造影劑和腫瘤周圍組織吸收的巨大差異，使得結果具有很好的對比度，能夠較完整的保留微血管結構。對斷層圖進行簡單的光照強度歸一化后，導入三維圖像處理軟件Amira (Mercury Computer Systems,Inc./TGS Group)，觀察腫瘤新生血管的三維圖像。

2 圖像分析

2.1 圖像處理

由于大量的微血管直徑約為20mm左右，采用單一閾值分割勢必會過分割或欠分割，無法較好地提取完整而正確的腫瘤新生血管網絡，因此采用雙閾值完成血管的分割。首先，利用Frangi提出的基于不同尺度空間的血管增強濾波器，進行細小血管的增強[31]。由于該濾波器能夠自主選擇想要增強的管狀物體的尺度，因此僅采用較小尺度（sigma=1,2）增強細小血管，也避免了由于大尺度所造成的血管過度平滑和粘連的現(xiàn)象。另外，該濾波器對于背景噪聲也有較好的抑制作用，有利于接下來利用單一閾值進行細小血管的分割。然后，分別對增強前后的圖像進行閾值分割，得到較大的血管和較小的血管。將兩種圖像進行疊加，運用形態(tài)學閉操作填補疊加后的斷層血管內部的空洞，同時運用開操作和重構去掉長度過短（根據實驗樣本測試得出結構元素取線型，長度取15像素效果最好）的物體后，得到最終的分割結果。

2.2 圖像分區(qū)

如圖1所示，取腫瘤中間三分之一段的三維圖像進行統(tǒng)計分析，并且按照不同的半徑將選區(qū)分為三個互不相交的子分區(qū)，分別稱作外圍區(qū)域（R1）、過度區(qū)域（R2）和中心區(qū)域（R3），其目的在于探討腫瘤生長過程中不同區(qū)域內血管生長變化與分布的關系。(a)20 d腫瘤的部分采樣區(qū)域的體繪制；(b)以不同顏色來分別表示不同的分區(qū)，從外到內依次為1區(qū)、2區(qū)、3區(qū)。重建后的數據，首先經過預處理解決斷層之間光照不均的現(xiàn)象，接著利用雙閾值法分割，最后對分割后的血管網絡進行血管密度和分形維度的統(tǒng)計分析。

圖1 腫瘤分區(qū)示意圖。Fig.1 A simple illustration of rezoning from a vertical view

2.3 定量指標

對每一個樣品的不同區(qū)域分別計算MVD和FD。

分形維度描述分形物體對其所在空間填充程度，其計算方法主要有豪斯多夫維數、計盒維數和沙盤維數等，其中最常用是盒維數。盒維數的計算是通過用無數個邊長為r均勻分割的網格來劃分分形物體，然后數出最少需要多少個網格來覆蓋這個分形，記為N。這樣對網格逐漸精細下去，所需用來覆蓋的網格數逐漸增加，因此網格大小、覆蓋所需網格數和分形維度之間的關系如下：

當 r I 0 時，可得到：

本實驗中采用盒維數來代表腫瘤微血管的分形維度，簡稱FD。

3 結果

3.1 腫瘤體積變化

將4T1乳腺癌細胞接種于小鼠右側股部背側皮下，待該瘤體生長20 d、25 d、30 d、35 d、40 d時，測得腫瘤體積分別為（0.088±0.025）cm3、（0.195±0.058）cm3、（0.512±0.068）cm3、（0.686±0.151）cm3、（0.988±0.276）cm3。腫瘤體積隨時間一直在不斷增大，并且在20 d到25 d變化較為緩慢，而25 d到30 d的增幅最大。

圖2 皮下接種4T1細胞后腫瘤的生長曲線 （n=3）Fig.2 Growth of tumor after injected subcutaneous transplantation of 4T1 cells(n=3)

3.2 瘤內微血管形態(tài)變化

從腫瘤的CT圖像重建后的體繪制圖（圖3和圖4）可以看出，腫瘤內部新生血管分布不均勻，局部血管呈絮狀，分布密集，雜亂無章，有許多較大的無血管區(qū)域。20 d的腫瘤血管較粗；20 d到25 d腫瘤血管迅速增加，且以細小血管為主，極為密集；到30 d MVD明顯下降，形成大片的無血管區(qū)域；隨后腫瘤MVD遞減，到40 d僅剩在靠近腫瘤邊緣的地方有少量血管。

圖3 隨時間增長瘤內微血管的形態(tài)變化Fig.3 Development of tumor microvascular over time

圖4 20 d腫瘤血管的三維重建圖Fig.4 Visualization of reconstructed tumor microvessel structure of Day 20

3.3 分區(qū)定量結果

為了更好的研究腫瘤血管不同區(qū)域的分布情況，將腫瘤中間三分之一段取出，然后按半徑從外到內依次劃分為三個區(qū)域(圖1)，分別稱作外圍區(qū)域(1區(qū))、過度區(qū)域(2區(qū))和中心區(qū)域(3區(qū))，對腫瘤進行分區(qū)域的MVD和FD計算，結果圖5所示。每個分區(qū)內的血管密度隨時間呈拋物線分布，25 d時MVD最大，40 d時MVD最小。從觀察MVD的空間分布(圖3)來看，20 d到25 d時血管分布較為均勻，25 d以后中心血管密度減少較快。與MVD結果一致的是FD也在25 d達到最大，此后逐漸遞減，到40d時FD最小，且越往中心FD越小。預示著腫瘤血管在量變的同時也有著“質”的變化，即結構復雜度的變化。FD的數值范圍，與以前關于腦腫瘤分形結果相符[30]。

表1 不同生長時間、不同分區(qū)的腫瘤微血管密度的統(tǒng)計結果Tab.1 Quantitative estimates of microvessel density(MVD)of different growth periods and different subregions.

表2 不同生長時間、不同分區(qū)的腫瘤微血管分形維度的統(tǒng)計結果Tab.2 Quantitative estimates of microvessel fractal dimension(FD)of different growth periods and different subregions

圖5 不同時間和不同分區(qū)內的MVD和FD分布圖（n=3）Fig.5 Microvessel density and fractal dimension distribution at different time and in different locations(n=3).

5 討論

實驗得出的不同生長時間腫瘤微血管網絡的分形維度的變化趨勢與MVD的變化趨勢基本一致，均為先增大后減小，體現(xiàn)出腫瘤從增長到退化的一個生長周期。這個生長周期也包含著腫瘤內部微血管網絡密度和復雜度的共同變化。腫瘤從無到有再到40 d的生長時間過程中，25 d時腫瘤血管分行維度和血管密度同時達到最大，與直觀的觀測結果一致，體現(xiàn)腫瘤目前正處于高度活躍狀態(tài)，形態(tài)結構最為復雜。然而，從分別比較各個時間點的不同區(qū)域血管定量結果來看，中心區(qū)域血管密度始終較邊緣低，且血管體積在25 d到30 d這個過渡期出現(xiàn)了迅速飛躍，血管密度在25 d前后有著驟升和驟降的過程。由此推斷乳腺腫瘤在生長過程的前期(25 d前)和后期(25 d后)與腫瘤血管的生長速度變化有關。在腫瘤生長前期即20 d到25 d這段時間，腫瘤新生血管迅速增長，依次比較三個分區(qū)，第25 d的平均血管密度分別約為第20 d的9倍、7倍、9倍，而腫瘤平均體積由0.088增大到0.195，增大約2.2倍；第25 d到第30 d時，體積由0.195迅速增至0.512，增大約2.6倍。而各個分區(qū)內的平均血管密度則分別由0.0637、0.0598、0.0657下降了至0.0130、0.0038、0.0074，下降了至少約5倍以上，體積增長的速度遠遠大于血管新生的速度，使得血管密度在25 d到30 d的時候迅速下降。這可能與4T1細胞株的高度惡性有關，其生長后期腫瘤細胞繁殖過快與血管新生速度不匹配，導致營養(yǎng)供給跟不上，造成腫瘤內大量壞死和轉移。從實際解剖結果也可以看到，不同時間點腫瘤的肺轉移，符合該類惡性腫瘤的基本特征。

盡管FD變化趨勢與MVD一致，但是FD的統(tǒng)計方差卻遠遠小于MVD的。這不僅證明腫瘤血管并非預想中的單純由外向內的滲透性生長，或者即使是滲透型生長模式，那在不同區(qū)域其生長的速度也必然受到局部微環(huán)境的影響而會有所不同，個體差異顯著。另外，還證明分形與血管密度間的關系，不僅僅是單純意義上的百分比，更重要分形描述的是不同尺度下密度分布的相似性。這一特性使FD更適用于對于腫瘤血管的大面積篩查，而不必認為應選血管密集區(qū)域（如hot-spot[6]），進行定量，降低了人為因素的干擾，大大提高了定量結果的客觀性。

本研究以同步輻射CT成像為基礎，得到微米級的腫瘤內部微血管網絡，采用自主設計的分塊加載雙閾值分割方法進行定量前的準備，通過觀察不同時間的腫瘤體積和不同分區(qū)的血管密度和分形維度的變化趨勢，初步分析腫瘤隨時間變化的生長過程。實驗證明了分形分析對于研究腫瘤血管的潛力，也說明了對于復雜的腫瘤血管定量，不能靠單一指標進行描述，而需要多個指標進行綜合評定。這樣才能更加全面解讀腫瘤新生血管對于腫瘤生長的重要意義。

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