周 瑢，孔浩輝，何艷明，程志穎，張心穎

(廣東中煙工業(yè)有限責任公司，廣東廣州510145)

煙梗即是煙葉之粗硬葉脈，約占煙葉重的25%～30%，是煙草工業(yè)的主要副產(chǎn)物［1］。作為煙草生產(chǎn)大國，我國每年約有數(shù)十萬t煙梗廢棄物沒有得到合理的處理而被棄置。既對環(huán)境造成了污染，同時也是對自然資源的浪費［2］。生產(chǎn)煙草薄片是煙梗高值化利用的主要形式，目前世界卷煙工業(yè)對造紙法煙草薄片的使用越來越普遍，使用造紙法煙草薄片是煙草工業(yè)的發(fā)展趨勢［3］，該法是利用煙梗和廢棄煙葉(碎片、煙末)，經(jīng)浸取、打漿、調(diào)漿、抄片和涂布等工藝過程加工而制成重組煙葉。煙梗是制造煙草薄片的重要原料［4］，其比例可占到總量的50%～80%。但煙梗經(jīng)浸取、打漿、調(diào)漿等工藝過程，所得的煙梗提取液中含有較多蛋白質(zhì)、淀粉、果膠等大分子，導致煙草薄片存在雜氣重、刺激性大和口感不適等吸味缺陷，最終影響到煙草薄片的感官質(zhì)量。國內(nèi)外研究表明［5－7］，通過微生物發(fā)酵能夠大大縮短煙葉醇化的時間，明顯消除煙葉的青雜氣，減輕刺激性，并且對煙葉香氣質(zhì)量的改善有一定的促進作用。本文采用生香酵母對煙梗提取液進行發(fā)酵處理，研究生香酵母發(fā)酵對煙梗提取液的各項性質(zhì)的影響，對微生物發(fā)酵改善煙梗提取液性質(zhì)的可能性進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙梗 廣東中煙工業(yè)有限責任公司原料研究所提供;檸檬酸、檸檬酸鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉 均為分析純;安琪生香酵母 本實驗室從安琪酵母粉上分離獲得;YPD培養(yǎng)基。

7890氣相色譜儀 美國Agilent公司;1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司，配備G1378B脫氣機、G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱和G1362A示差折光檢測器;CP2245電子天平 感量0.0001g，德國 Sartorius公司;DSHZ－300A恒溫水浴搖床 太倉市實驗設備公司;ZHWY－200D恒溫氣浴搖床 上海智誠;QZ－18(B7)電磁爐 廣州市九陽家電有限公司;FZ102粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;Centrifuge 5804R離心機 德國Eppendorf;50mL圓底燒瓶，250mL三角瓶，容量瓶等玻璃儀器;731型紫外－可見分光光度計、DSX－280A型高壓滅菌鍋 上海;SVE－4A1無菌操作臺 新加坡ESCO;HP250S電熱恒溫培養(yǎng)箱 湖北。

1.2 煙梗提取液的制備

取10.0g煙梗粉末于250mL三角瓶中，加入8倍重量的水，于50℃恒溫水浴搖床，250r/min轉速下振蕩提取1h，如此反復三次，合并液體，得到煙梗提取液。

表1 發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)及發(fā)酵液pH的變化Table 1 Changes of the yeast number and fermentation broth pH during fermentation

1.3 煙梗提取液發(fā)酵

將生香酵母菌株轉接到YPD培養(yǎng)基斜面，于30℃活化培養(yǎng)12h。取數(shù)個250mL三角燒瓶，在每個燒瓶中裝入煙梗提取液200mL，放入高壓蒸氣滅菌鍋，于115℃滅菌20min，冷卻至室溫，待用。取一活化培養(yǎng)好的生香酵母菌株斜面，吸取5mL無菌水洗下菌落，制成菌懸液。在一瓶已滅菌的煙梗提取液培養(yǎng)基中接入1mL菌懸液，放入30℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)2d;同時，在2瓶已滅菌的煙梗提取液中各加入同樣量的無菌水，并在同樣條件下進行處理(對照)。將接菌和未接菌發(fā)酵的煙梗提取液分別作為發(fā)酵樣品和對照樣品進行分析檢測或提取分離。在發(fā)酵過程中每隔12h監(jiān)測其pH、酵母菌數(shù)、各種單糖含量及主要的香氣成分量。

1.4 測定方法

1.4.1 有機酸成分的測定［8］稱取2g煙梗提取液置于15mL具塞離心管中，加入100μL己二酸內(nèi)標溶液，加入2mL 10%(V/V)硫酸甲醇溶液，振搖5min，室溫放置過夜，進行甲酯化反應。然后加入5mL去離子水，5mL氯仿，萃取后離心(2000r/min)，取下層清液進樣。

氣相色譜條件:DB－5(60m×0.32mm×0.25μm)毛細管色譜柱(J＆W 公司);進樣量:1μL，不分流進樣方式;進樣口溫度:250℃;載氣:He，2.2mL/min;程序升溫:45℃下保持2min，然后以6℃/min的速率升至180℃，再以10℃/min的速率升至 260℃，保持10min;檢測器:FID;檢測器溫度:300℃。

1.4.2 高效液相色譜測糖含量 稱取一定量的已粉碎的煙草樣品，以50%的乙腈水溶液振蕩萃取樣品30min，取液體過 0.45μm有機濾膜，上液相色譜分析。

液相色譜條件:Waters X bridge Amide(4.6mm×250mm，3.5μm)糖分析柱;柱溫85℃;RID 檢測器;流動相:70%(體積分數(shù))乙腈/30%水預混合溶液，等梯度洗脫;進樣量:10μL;進樣模式:洗針進樣;流速:0.8mL/min;停泵時間:20min。

1.4.3 主要香氣成分檢測方法［9］稱取15g提取液，以二倍體積的二氯甲烷超聲提取20min，分液漏斗過濾，水相再以二倍體積二氯甲烷超聲提取20min，反復三次，收集二氯甲烷相，45℃常壓旋轉蒸餾二氯甲烷萃取液至1mL濃縮液，加入無水硫酸鈉去除水分，進行氣質(zhì)分析。

GC條件如下:色譜柱:DB－FFAP(30m×0.25mm×0.25μm);載氣:He，流量 1.0mL/min;分流比30∶1;進樣量為1μL;進樣口溫度:250℃;程序升溫:60℃，維持2min，5℃/min升至250℃，維持10min。MS條件如下:傳輸線溫度:260℃;離子源溫度:230℃;四級桿溫度:150℃;電離電壓:70eV;質(zhì)量數(shù)范圍:50～550amu;MS譜庫:Wiley05+Nist08串聯(lián)檢索;采用丙酸苯乙酯內(nèi)標法定量。

1.4.4 pH測定方法 將發(fā)酵液冷卻至室溫，以pH計測定其pH。

1.4.5 發(fā)酵液中酵母菌數(shù)測定 采用平板菌落計數(shù)法。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵過程中生香酵母菌數(shù)的變化和發(fā)酵液pH的變化

對發(fā)酵液pH進行測定，結果如表1所示。在接種前，生香酵母菌菌懸液的酵母菌數(shù)為2.7×104個，處于對數(shù)生長期，酵母菌菌數(shù)顯著增加，24h后達到2.63×107個，幾乎增加了1000倍。隨著發(fā)酵時間的延長，酵母發(fā)酵由生長期轉向穩(wěn)定期，菌數(shù)增加緩慢，24～48h，酵母菌數(shù)增長不到10%。48h后，進入衰亡期，故發(fā)酵時間不能超過48h。發(fā)酵過程中，發(fā)酵液pH隨發(fā)酵時間先降低后趨于平衡，0～12h發(fā)酵液pH降低最大，降低了0.95;12～24h發(fā)酵液pH仍然降低，但降低較小，12h后發(fā)酵液pH維持在4.40左右。

2.2 發(fā)酵過程中煙梗提取液中各種糖含量變化

糖對卷煙燃吸口味有重要的積極作用，對發(fā)酵過程中各種糖的量進行測定，采用HPLC考察了發(fā)酵過程中葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖的含量(圖1)，可以看出葡萄糖在0～24h顯著降低，此時由于菌體大量的生長繁殖，需要大量的直接能源;24h后菌體生成達到穩(wěn)定期，生長緩慢，其含量變化不大。果糖、蔗糖和麥芽糖在整個過程中變化不顯著。從而可以得出，生香酵母在發(fā)酵過程中，主要以葡萄糖作為其碳源提供其生產(chǎn)繁殖所需的能量，后續(xù)在發(fā)酵液的處理過程中，為平衡發(fā)酵液性質(zhì)，更好地用于煙草行業(yè)，需補充葡萄糖。

圖1 發(fā)酵過程中幾種糖隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Changes of several sugar contents during fermentation

2.3 發(fā)酵過程中有機酸含量的變化

有機酸在卷煙燃吸過程中能醇和吸味，降低燃吸的刺激性。為了更深入地了解發(fā)酵對煙梗提取液中有機酸性物質(zhì)的影響，采用有機酸的氣相色譜分析法檢測煙梗提取液中的有機酸性物質(zhì)。結果見表2，煙梗提取液中，半揮發(fā)性有機酸(主要為高級脂肪酸)，棕櫚酸、油酸、亞油酸和硬脂酸的含量基本相當。在發(fā)酵過程中，非揮發(fā)性酸含量隨時間變化顯著，乳酸和丙二酸在12h時，含量達到最大，隨后又隨時間變小并趨于恒定，而乙酰丙酸含量在整個發(fā)酵過程隨時間不斷增大。有機酸總量在48h達原含量的2.8倍。

表2 發(fā)酵過程中各種有機酸含量(mg/mL)Table 2 Organic acids contents during fermentation(mg/mL)

表3 不同發(fā)酵時間處理后主要香氣成分的變化(μg/g)Table 3 Changes of main aroma components after different treatment time(μg/g)

2.4 不同發(fā)酵時間處理后主要香氣成分的變化

表3為不同發(fā)酵時間下香氣成分的變化情況，煙梗提取液經(jīng)生香酵母發(fā)酵后香氣成分在一定程度上得到提高。隨著發(fā)酵時間的延長，總香氣成分含量不斷增加，發(fā)酵24h時，香氣物質(zhì)含量增加了97.21%;發(fā)酵36h，香氣物質(zhì)含量增加了109.32%;發(fā)酵48h后，香氣成分總量增加了172.13%，為原含量的2.7倍。其中苯乙醇在整個發(fā)酵過程中增加顯著，發(fā)酵48h后，增加了47.1倍。苯乙醇是烤煙的揮發(fā)油中最重要的致香化合物之一，可使煙氣增加花香的香味［10］。

3 結論與討論

3.1 生香酵母在煙梗提取液中生長，48h后進入衰亡期，為保證發(fā)酵質(zhì)量，發(fā)酵時間不得超過48h。煙梗提取液經(jīng)生香酵母發(fā)酵后，可溶性還原糖含量降低，而有機酸性成分含量增加，這種變化類似于在醇化過程中所經(jīng)歷的化學變化趨勢［11］。

3.2 可溶性糖含量降低，其中以葡萄糖含量降低為主，果糖、蔗糖、麥芽糖等含量變化不大，表示生香酵母在發(fā)酵煙梗提取液時，以葡萄糖為主要的碳源。但葡萄糖降低將對煙氣產(chǎn)生不利影響，因此在后續(xù)的應用中需補加葡萄糖。在整個發(fā)酵過程中，有機酸含量增高，特別是非揮發(fā)性有機酸含量顯著增高，從而使提取液酸值升高，非揮發(fā)性有機酸對卷煙抽吸質(zhì)量有重要作用，它們能與生物堿結合成鹽，調(diào)節(jié)質(zhì)子化和游離態(tài)煙堿比例，調(diào)節(jié)煙氣pH，使煙氣平和，吸味改進，濃度增加。煙梗提取液經(jīng)生香酵母發(fā)酵后香氣成分總量在一定程度上得到提高，較未發(fā)酵相比，發(fā)酵48h后總香氣成分增加了172.13%，其中烤煙揮發(fā)油最重要的致香成分之一苯乙醇增加了47.1倍。

3.3 綜上所述，生香酵母發(fā)酵煙梗提取液，能明顯改善提取液的性質(zhì)，這將有利于提高煙梗在制造煙草薄片中的價值，因為生香酵母的生長需要利用葡萄糖作為碳源，而葡萄糖對平衡煙氣吸味具有積極作用，在下一步的研究中，需要研究葡萄糖的補加技術。

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