梁思思，李珺嶠，石 磊，吳希陽，*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510600;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東廣州510600)

大腸埃希氏菌(E.coli)俗稱大腸桿菌，是埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌，是環(huán)境中常見的菌［1］。在一定的條件下，某些血清型的大腸桿菌會(huì)引起人或者動(dòng)物患上各種病，如引起禽類的腹膜炎、氣囊炎等疾病。隨著抗生素和抗菌藥物的大量開發(fā)，人們不恰當(dāng)?shù)厥褂每咕幬?，使得大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥日趨嚴(yán)重。我國是世界上濫用抗生素最嚴(yán)重的國家，不合理使用抗生素的現(xiàn)象普遍存在，使得大腸桿菌耐藥性在巨大用藥壓力下逐漸增強(qiáng)［2－5］，從耐藥低水平到耐藥高水平，從單重耐藥到交叉多重耐藥的發(fā)展，這引起醫(yī)學(xué)界和社會(huì)的極大關(guān)注。細(xì)菌間基因的水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌多重耐藥性形成和廣泛傳播的重要原因。整合子介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥機(jī)制，因能解釋耐藥基因的高效快速傳播而備受研究者關(guān)注。研究表明，細(xì)菌通過整合子系統(tǒng)，在整合酶作用下，不斷從周圍環(huán)境捕獲外來耐藥基因，從而使細(xì)菌具有耐藥性。整合子作為可移動(dòng)基因元件，可捕獲和整合細(xì)菌的耐藥基因，在細(xì)菌耐藥性的傳播和擴(kuò)散中起到了至關(guān)重要的作用［6－8］。通常以整合酶的存在與否判斷細(xì)菌內(nèi)是否存在整合子。目前根據(jù)整合子中整合酶基因(intI)的不同，將已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的整合子分為六類，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子最常見［9］。在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中，抗生素作為飼料添加劑來預(yù)防疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長，這樣低劑量長期的使用，導(dǎo)致動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境中致病性大腸桿菌耐藥菌株大量產(chǎn)生，這些耐藥菌通過多種途徑進(jìn)行傳播，或?qū)⑵淠退幓蛲ㄟ^畜禽產(chǎn)品直接傳遞給人類致病菌，引起交叉耐藥，對(duì)人類的健康造成了嚴(yán)重威脅［10－11］。目前對(duì)臨床分離的大腸桿菌的耐藥基因和整合子攜帶情況分析和研究的報(bào)道很多，但國內(nèi)外對(duì)來自整個(gè)魚塘生態(tài)系統(tǒng)的大腸桿菌耐藥基因和整合子的研究還比較鮮見。本文對(duì)165株來自魚塘生態(tài)系統(tǒng)的大腸桿菌攜帶耐藥基因和整合酶基因的情況進(jìn)行了檢測(cè)，通過檢測(cè)整合酶基因的存在與否判斷大腸桿菌是否攜帶有整合子基因，并且分析魚塘生態(tài)系統(tǒng)中耐藥基因和整合子的流行狀況。

表1 整合酶引物Table 1 Primers of integrase

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來源 165株菌，來自佛山南海某魚塘生態(tài)系統(tǒng)，包括鴨的腸道、鴨周邊生活環(huán)境的水體、土壤，魚的腸道、魚生活環(huán)境的水體、土壤。菌株接種，經(jīng)過生化鑒定，再用大腸埃希菌鑒定引物uspA進(jìn)行PCR檢測(cè)，最后確定為大腸桿菌;Mutiplex PCR Assay Kit、100bp marker 寶生物工程(大連)有限公司。

TC－25/H型基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司;6321ZJ604721型Mastercycler pro梯度PCR儀艾本德(中國)有限公司;凝膠成像儀 SERIALN;電泳儀 JNUYI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模板制備 參考文獻(xiàn)［12］，用煮沸法制備PCR模板DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)所需要檢測(cè)的19種耐藥基因序列分別設(shè)計(jì)具有相同或者相近退火溫度的引物，分為三組。19種抗生素耐藥基因?yàn)?sulI(磺胺)、SHV(β－內(nèi)酰胺類)、CAT1(氯霉素)、dhfrV(甲氧芐啶)、FloR(氟甲砜霉素)、aadA(氨基糖苷類)、OXA(β－內(nèi)酰胺類)、TEM(β－內(nèi)酰胺類)、cmlA(氯霉素)、CITM(氨芐青霉素)、ereA(大環(huán)內(nèi)酯類)、dhfrI(甲氧芐啶)、aac(3)－I(慶大霉素)、aphA－1(氨基苷類)、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV(阿普拉霉素)、FOXM。整合酶引物的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［5，13－14］。如表1 所示。

反應(yīng)總體系如表2所示。整合酶檢測(cè)反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃ 退火0.5min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 延伸 7min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌耐藥基因多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 耐藥率分析結(jié)果 對(duì)165株來自魚塘生態(tài)系統(tǒng)的大腸桿菌進(jìn)行19種耐藥基因分析，PCR結(jié)果顯示，帶有一種以上的耐藥基因的菌株有151株，陽性率為91.51%。165株大腸桿菌普遍攜帶氯霉素、β－內(nèi)酰胺類TEM、氨基苷類aphA－1耐藥基因。其中氯霉素類cmlA的陽性率最高，在165株中有105株菌攜帶氯霉素類 cmlA耐藥基因，陽性率為63.64%，其次是β－內(nèi)酰胺類TEM，有82株菌檢出攜帶β－內(nèi)酰胺類TEM耐藥基因，陽性率為49.70%。氨基糖苷類中以鏈霉素耐藥基因陽性率最高，35.15%(58/165);頭孢類藥物耐藥基因的攜帶情況表現(xiàn)為對(duì)氨芐青霉素的耐藥基因攜帶率高，MOXM和CITM的陽性率分別為29.46%(33/112)，3.03%(5/165)。詳細(xì)結(jié)果如表3所示。

對(duì)不同來源的大腸桿菌進(jìn)行分類別比較，其中TEM(β－內(nèi)酰胺類)、cmlA(氯霉素)和 aadA(氨基糖苷類鏈霉素)在鴨腸、鴨水、鴨土、魚腸、魚水、魚土中都有檢出。TEM的檢出率分別為59.34%、25.00%、40.74%、40.00%、58.33%、20.00%;氯霉素 cmlA 的檢出率比較高，分別為 63.74%、100.00%、25.93%、90.00%、83.33%、20.00%;aadA(鏈霉素)的檢出率分別為 43.96%、10.00%、37.04%、50.00%、8.33%、20.00%。在鴨腸中，(氨基苷類)aphA－1攜帶率高達(dá)96.00%;在鴨水中，cmlA(氯霉素)攜帶率高達(dá)100%;在魚腸和魚水中dhfrl(甲氧芐啶)攜帶率均為100%。詳細(xì)結(jié)果如表4所示。

2.1.2 多重耐藥水平分析 對(duì)大腸桿菌進(jìn)行多重PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究選用的大腸桿菌最多帶7種耐藥基因 (FloR、aadA、TEM、cmlA、aphA－1、MOXM、aac(3)－IV)，帶四種以上耐藥基因的菌株占46.05%，帶2、3、4、5 種耐藥基因的菌株分別有 31、35、47、18株，分別占總菌株數(shù) 18.79%、21.21%、28.48%、10.91%。在攜帶多重耐藥基因的菌株中，集中在攜帶2～5種耐藥基因。

表3 大腸桿菌19種耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection of 19 resistant genes of E.coli

表4 不同來源大腸桿菌耐藥基因檢出率(%)Table 4 Frequencies of resistant genes of E.coli from different sources(%)

2.2 大腸桿菌整合酶多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

選擇帶有四種耐藥基因以上的菌株(74株)的DNA作為模板，用多重PCR法擴(kuò)增三類整合酶基因，快速篩選出陽性菌株，結(jié)果擴(kuò)增出大小約為565、403bp左右的片段，與陽性對(duì)照確認(rèn)為Ⅰ型整合酶基因和Ⅱ型整合酶基因。74株菌株中，檢出Ⅰ整合酶基因陽性菌株的有65株，檢出率為87.84%;Ⅱ型整合酶基因陽性菌株有8株，檢出率10.81%;1株為陰性。檢測(cè)中沒發(fā)現(xiàn)有攜帶Ⅲ型整合酶基因菌株。結(jié)果如圖1、表5所示。

不同來源的攜帶多種耐藥基因的大腸桿菌幾乎全部都攜帶有Ⅰ型整合酶基因，攜帶型Ⅱ整合酶基因的菌株全部來源于鴨腸。如表6所示。

表5 整合酶檢測(cè)結(jié)果Table 5 Test result of integrase genes

3 討論

3.1 細(xì)菌耐藥狀況越來越嚴(yán)峻，而且耐藥率、多重耐藥還有逐年上升的趨勢(shì)。大腸桿菌很容易產(chǎn)生耐藥性，從而使抗菌藥物藥效降低甚至消失。讓人擔(dān)憂的是，大腸桿菌的耐藥性呈進(jìn)行性增長，這對(duì)于由于大腸桿菌感染引起的疾病的治療帶來潛在的危機(jī)。因此以對(duì)大腸桿菌的耐藥性調(diào)查以及對(duì)大腸桿菌耐藥機(jī)制進(jìn)行研究具有重要的意義，從而為解決細(xì)菌耐藥問題提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［15］。目前，大多數(shù)的研究者都集中于臨床分離的大腸桿菌的耐藥性研究，對(duì)整個(gè)魚塘生態(tài)系統(tǒng)大腸桿菌耐藥基因和整合子攜帶情況的研究還鮮有報(bào)道。隨著抗生素在養(yǎng)殖業(yè)上的廣泛使用和環(huán)境中耐藥菌的增多，我們有必要對(duì)來源于養(yǎng)殖業(yè)的大腸桿菌耐藥基因的攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)和研究細(xì)菌耐藥傳播。

表6 不同來源大腸桿菌整合酶基因攜帶率Table 6 Frequencies of integrase genes of E.coli from different sources

圖1 整合酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR result of integrase genes

3.2 本實(shí)驗(yàn)的165株大腸桿菌來自魚塘生態(tài)系統(tǒng)中的鴨腸、鴨水、鴨土、魚腸、魚水、魚土，對(duì)其進(jìn)行19種耐藥基因(Sul1、SHV、CAT1、dhfrV、FloR、aadA、OXA、TEM、cmlA、CITM、ereA、dhfrl、aac(3)－1、FOXM、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV、aphA－1)的多重PCR檢測(cè)。PCR結(jié)果顯示，帶有一種以上的耐藥基因的菌株有151株，陽性率為91.51%。這表明大腸桿菌中普遍帶有耐藥基因，其中以氯霉素類、β－內(nèi)酰胺類的耐藥基因居多。從多重耐藥水平來看，攜帶2種及2種以上耐藥基因的大腸桿菌比率為86.06%。在攜帶多重耐藥基因的菌株中，集中在攜帶2～5種耐藥基因。這些說明大腸桿菌的耐藥水平已經(jīng)不再停留在低水平的耐藥水平了，向多重耐藥、交叉耐藥水平發(fā)展。再對(duì)帶有4種耐藥基因以上的菌株進(jìn)行整合酶基因檢測(cè)，結(jié)果98.65%的菌株攜帶有Ⅰ型整合酶基因或Ⅱ型整合酶基因，沒有檢出Ⅲ型整合酶基因。其中Ⅰ型整合子酶基因檢出率高達(dá)87.84%?？梢?，在整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制中，以Ⅰ型整合子為主。

3.3 Ⅰ類整合子的存在與否明顯影響著大腸桿菌的耐藥性和多重耐藥率、耐藥譜，是基因水平監(jiān)測(cè)多重耐藥性的重要指標(biāo)［13－14，16－17］。魚塘生態(tài)系統(tǒng)中的鴨腸，鴨水，鴨土，魚腸，魚水，魚土中都檢測(cè)出攜帶有耐藥基因和整合子。這說明在這個(gè)魚塘生態(tài)系統(tǒng)中，攜帶耐藥基因和整合子的菌株普遍都有分布，而多重耐藥大腸桿菌株中整合子基因又普遍存在。因此整合子可能是誘發(fā)大腸桿菌多重耐藥的重要原因，并且耐藥基因通過整合子可移動(dòng)的特點(diǎn)向周圍環(huán)境傳播，從而使得周圍環(huán)境的菌株產(chǎn)生多重耐藥、交叉耐藥。

4 結(jié)論

對(duì)魚塘生態(tài)系統(tǒng)及其周圍環(huán)境進(jìn)行取樣檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，周圍的環(huán)境中的菌株都不同程度地?cái)y帶有耐藥基因和整合子酶基因。其中攜帶多重耐藥基因的菌株中，Ⅰ類整合酶基因的占大多數(shù)。耐藥基因可能通過整合子的整合作用向周圍環(huán)境擴(kuò)散，使得周圍環(huán)境的菌株出現(xiàn)不同程度地耐藥基因增多。

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