張佳宜

（天津科技大學(xué)，天津 300457）

動(dòng)物性食品中磺胺二甲嘧啶快速檢測(cè)方法

張佳宜

（天津科技大學(xué)，天津 300457）

根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行磺胺二甲嘧啶在雞肉和鯽魚(yú)中的殘留檢測(cè)研究?；前范奏奏ぐ肟乖?OVA和羊抗兔二抗分別作為檢測(cè)帶（T線）和質(zhì)控帶（C線）包被在硝酸纖維素膜上，金標(biāo)抗體噴涂在玻璃纖維墊上，制成免疫層析快速檢測(cè)試紙條。所建立的檢測(cè)體系對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的靈敏度達(dá)到1 μg/L。成功檢測(cè)了雞肉和鯽魚(yú)中的磺胺二甲嘧啶殘留。該方法靈敏度高，所用試劑無(wú)毒、無(wú)污染，無(wú)需借助儀器，樣品前處理簡(jiǎn)便，快速，檢測(cè)過(guò)程可在10 min內(nèi)完成，可以作為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中磺胺二甲嘧啶殘留的有效手段。

膠體金；免疫層析；磺胺二甲嘧啶；快速檢測(cè)

磺胺二甲基嘧啶（SMZ）是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用最廣泛的磺胺類藥物之一，常被添加到飼料中，用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療。長(zhǎng)期添加或?yàn)E用可導(dǎo)致動(dòng)物性食品中的藥物殘留，人食用含有SMZ藥物殘留的食品后，會(huì)影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)，破壞肌肉、腎臟和甲狀腺等組織，同時(shí)SMZ也有致腫瘤傾向[1]。另一方面容易產(chǎn)生耐藥菌株，使藥物失去治療疾病的價(jià)值[2]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，SMZ的殘留現(xiàn)象非常嚴(yán)重，經(jīng)常在畜禽和水產(chǎn)品中出現(xiàn)。

目前，檢測(cè)SMZ殘留應(yīng)用最廣泛的是高效液相色譜法[3]。這種方法靈敏度高，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需特殊儀器，投入成本高，不適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速篩選。膠體金免疫層析法（GICA）是20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的一種快速免疫檢測(cè)技術(shù)，它基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，是將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)[4]。該方法最大特點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速、靈敏準(zhǔn)確、成本低廉、不需任何儀器設(shè)備，檢測(cè)結(jié)果清楚，易于判斷。本論文選取雞肉和鯽魚(yú)2種檢測(cè)樣品，研究了利用免疫膠體金試紙條快速檢測(cè)2種樣品中SMZ殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

ZQ2000切條機(jī)、HM3020劃膜儀、結(jié)合釋放墊、PVC背板：上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜、吸收墊、樣品墊：Millipore；氯金酸：上海化學(xué)試劑有限公司；SMZ 標(biāo)準(zhǔn)品、羊抗兔二抗、BSA：Sigma；SMZ抗體、包被抗原（SMZ-OVA）：天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；雞肉和鯽魚(yú)為市售，經(jīng)液相檢測(cè)為不含磺胺類藥物的陰性樣品；封閉液：1%BSA-PBS；洗滌液：PBST（含 0.05%Tween-20 的 PBS）；紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)CARY 50 Bio，Varian。

1.2 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法[5]制備40 nm膠體金：1%的檸檬酸三鈉水溶液1 mL加入到100 mL 0.01%的HAuCl4水溶液中。

1.3 膠體金標(biāo)記抗體蛋白

取20 mL膠體金溶液，用0.1 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH到9.0，在磁力攪拌下，逐滴加入0.48 mg純化后的抗體，10 min后逐滴加入10%的BSA使溶液中BSA終濃度為1%，以穩(wěn)定膠體金標(biāo)記物，攪拌30 min后置于4℃過(guò)夜。分裝到1 mL離心管中，10000 r/min離心30 min，棄上清。用儲(chǔ)存液溶解，重復(fù)上一步離心，棄上清，用儲(chǔ)存液重懸為原體積的1/10，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試紙條的組裝

用劃膜儀將羊抗兔二抗（0.5 μL/strip）與SMZOVA（0.8 μg/strip）包被在 NC 膜上，作為質(zhì)控帶和檢測(cè)帶；將金標(biāo)抗體稀釋后30 μL/cm噴涂于玻璃纖維上，作為結(jié)合釋放墊。在PVC背板上依次粘貼吸收墊、硝酸纖維素膜、結(jié)合釋放墊、樣品墊，然后用切條機(jī)切成條狀（60 mm×4 mm），密封干燥保存。

1.5 方法檢出限的測(cè)定

將SMZ標(biāo)準(zhǔn)品用含10%甲醇的PBST溶液稀釋成一系列梯度，將制備好的試紙條插進(jìn)上述梯度稀釋液中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，5 min后取出，目視辨別顏色深淺，在質(zhì)控帶顯色的情況下，檢測(cè)帶顏色越淺，代表SMZ含量越高。以能與空白對(duì)照有明顯色差的最小濃度為最低檢出限。

1.6 樣品預(yù)處理

雞肉：稱取2 g樣品，加4 mL甲醇旋渦振蕩提取2 min，過(guò)濾，濾液用PBST稀釋10倍待測(cè)。

鯽魚(yú)：稱取2 g樣品，加4 mL甲醇旋渦振蕩提取2 min，過(guò)濾，濾液用PBST稀釋5倍待測(cè)。

1.7 樣品的檢測(cè)

對(duì)于2種樣品采用對(duì)待測(cè)物（SMZ）進(jìn)行添加回收的方法，向雞肉和鯽魚(yú)2種陰性樣品中分別添加3個(gè)不同含量水平（雞肉添加 20、100、400 μg/kg；鯽魚(yú)添加10、50、200 μg/kg）的 SMZ，按照 2.7 的樣品預(yù)處理方法，提取后用膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將制作好的試紙條置于4℃冰箱內(nèi)密封保存。分別在 1、2、3、4、5、6 個(gè)月時(shí)取出進(jìn)行一系列濃度標(biāo)樣的測(cè)定，每次3組，觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的有無(wú)，條帶的清晰度以及玻璃纖維釋放金標(biāo)抗體的程度。

2 結(jié)果

2.1 膠體金質(zhì)量鑒定

膠體金溶液500 nm～600 nm的紫外掃描圖譜，如圖1。

圖1 膠體金的500 nm～600 nm紫外掃描圖Fig.1 Spectrum(500 nm-600 nm)of colloidal gold

只有一個(gè)最大的吸收峰λmax=525 nm，OD525=1.588，而且峰寬較小，波形光滑，說(shuō)明制得的膠體金溶液的顆粒大小比較均勻。

用肉眼觀察，可見(jiàn)膠體金溶液外觀呈深紅色，色澤均勻清亮，表面沒(méi)有漂浮物。經(jīng)膠體金電鏡觀察結(jié)果如圖2。

圖2 膠體金的電鏡掃描圖Fig.2 Transmission electron micrograph of colloidal gold

從圖2可以看出所制備的膠體金顆粒大小均勻，最終測(cè)得的粒徑平均大小（n=50）為40 nm。

2.2 檢出限的確定

圖3為在最佳的試驗(yàn)條件下檢測(cè)不同濃度SMZ的結(jié)果示意圖。

結(jié)果表明：隨著SMZ濃度的升高，檢測(cè)帶逐漸變淺。當(dāng)SMZ濃度低于1 μg/L時(shí)，檢測(cè)線顯色結(jié)果與空白溶液（不含SMZ）相比無(wú)法通過(guò)目測(cè)區(qū)別，當(dāng)SMZ的濃度為1 μg/L，顏色與空白溶液雖然很接近，但仍能通過(guò)目測(cè)將兩者區(qū)分，因此膠體金免疫層析法檢測(cè)SMZ的方法檢出限為1 μg/L。

圖 3 GICA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（SMZ 濃度從左至右為：0、1、5、20 μg/L）Fig.3 Detection by GICA(the concentration of SMZ from left to right:0,1,5,20 μg/L)

2.3 樣品的測(cè)定

向雞肉和鯽魚(yú)兩種動(dòng)物性食品中分別添加一定濃度的SMZ，結(jié)果如圖4所示。

圖4 SMZ試紙條對(duì)2種樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Determination of SMZ in four spiked samples

由圖4表明：對(duì)于2種樣品，當(dāng)添加SMZ濃度分別為20 μg/kg和10 μg/kg時(shí)，檢測(cè)帶顏色能通過(guò)目測(cè)與空白區(qū)分。能夠滿足我國(guó)及國(guó)外所規(guī)定的磺胺二甲基嘧啶在所有可食用組織和奶中最高殘留限量（20 μg/kg）的要求。且由圖4可看出，添加不同濃度SMZ的樣品都可以得到明顯的梯度，說(shuō)明所優(yōu)化的提取方法有效，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

試紙條在4℃條件下放置6個(gè)月仍然穩(wěn)定可靠，梯度明顯，結(jié)合釋放墊釋放完全，條帶清晰，試紙條具有很好的穩(wěn)定性。6個(gè)月后穩(wěn)定性開(kāi)始下降，整體顏色變淺，不能正確判定檢測(cè)結(jié)果，因此無(wú)法用于樣品的檢測(cè)。最后確定SMZ試紙條的保存條件是在4℃干燥的條件下密封保存，有效期至少6個(gè)月。

3 結(jié)論與討論

采用檸檬酸三鈉還原法制備了40 nm膠體金，標(biāo)記抗磺胺二甲嘧啶多克隆抗體，優(yōu)化建立了免疫膠體金快速檢測(cè)方法，選取雞肉和鯽魚(yú)兩種動(dòng)物性食品，在2種樣品中SMZ的檢測(cè)限分別達(dá)到20 μg/kg和10 μg/kg，均滿足國(guó)內(nèi)外規(guī)定的磺胺二甲基嘧啶最高殘留限量的要求。通過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，確定SMZ試紙條的保存期限為4℃下密封干燥保存6個(gè)月，為進(jìn)一步研發(fā)磺胺類獸藥殘留檢測(cè)試劑盒提供參考。樣品前處理方法以及測(cè)定過(guò)程快速，簡(jiǎn)便，檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，適用于動(dòng)物源性食品中磺胺二甲嘧啶殘留的大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，在今后的獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域?qū)?huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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Development of Rapid Detection Assay for Sulphamethazine Residues in Animal Foods

ZHANG Jia-yi
（Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

The objective of the study is to establish a competitive assay based on the principle of immunoassay for the rapid on-site detection of Sulphamethazine(SMZ)residues in chicken and fish muscle.The SMZ-OVA and goat anti-rabbit IgG were dispense on test line and control line respectively and the polyclonal antibody was solidified to glass fibers to prepare immunochromatographic strips.The visual detection limit for SMZ is 1 μg/L.The test strip was used to detect SMZ from chicken and fish muscle samples spiked with SMZ standard solution.The method established is sensitive,the reagent is innocuous and free from contamination and that the procedure of determination is simple and quick,costing 10 minutes.It was proved to be widely used to detect the SMZ residues in animal foods on-site.

colloidal gold;immunochromatographic;SMZ;rapid detection

張佳宜（1983—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：化學(xué)、食品安全。

2011-12-27